背景:心肌梗死(myocardial infarction,MI)是由于冠状动脉血供急剧减少或者中断,引起相应的心肌缺血、缺氧,最终导致心肌坏死。心肌梗死后主要表现为心肌细胞肥大、凋亡,同时伴随着大量纤维细胞增殖、纤维细胞替代坏死的心肌细胞,引起心肌重构的发生,最终发展为失代偿性心力衰竭而导致死亡。心肌梗死是一种常见的心血管疾病,严重威胁着人类的健康,虽然近几十年来各种新药的研发和介入手术的开展,其并发症和死亡率大大降低,但是心肌梗死后引起的心肌重构,导致的心力衰竭仍在呈慢性进行性发展,最终走向终末期心力衰竭。钙蛋白酶(calpains)是一类存在于细胞内的半胱氨酸蛋白酶,包括14种亚型,其中以calpain-1和calpain-2表达最为广泛,两者的激活均依赖于细胞内钙离子的浓度,且均可被钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)所拮抗。近年研究表明,calpains的激活在心肌细胞肥大和凋亡中发挥着关键的作用,且calpains的表达情况与心力衰竭的程度呈正相关,然而calpains在心肌梗死后心肌重构中的作用及分子机制尚不清楚,且过表达calpastatin在心肌梗死后心肌重构过程中的作用报道甚少。故提出如下假设:calpains的激活在心肌梗死后心肌重构中发挥重要作用,过表达其抑制因子calpastatin后可抑制正常心肌骨架结构的降解和异常纤维组织的沉积。目的:以过表达的calpastatin转基因型小鼠为研究对象,评估过表达calpastatin抑制calpains后对心肌梗死后心肌重构过程的影响,旨在探讨calpain/calpastatin系统在梗死后心肌重构中的作用及分子机制。方法:1、calpastatin转基因型小鼠的构建、鉴定及繁殖;以c57bl/6j小鼠为遗传背景,采用人的calpastatin基因为靶基因,构建过表达calpastatin的转基因型小鼠。利用gateway克隆技术构建“prp.ex3d-ef1a-cast-ires-egfp”目的载体,并将目的基因片段溶于显微注射缓冲液中,通过显微注射法把目的基因注射到c57bl/6j小鼠受精卵中,并将其胚胎移植到同期发情的假孕受体母鼠的输卵管内,获得子代小鼠。采用pcr方法鉴定出阳性转基因小鼠,确定其首建鼠,并通过与野生型c57bl/6j小鼠回交数代后再互交数代建系。2、使用电子称称量野生型小鼠与转基因型小鼠的体重,使用罗氏血糖仪检测小鼠的空腹血糖,采用直接法或酶法检测小鼠的血糖;3、采用rt-pcr法检测转基因型小鼠各组织中calpastatinmrna的表达情况;4、采用rt-pcr法检测野生型小鼠与转基因型小鼠内源性calpastatinmrna的表达情况;5、采用westernblotting法检测野生型小鼠与转基因型小鼠心脏组织中calpastatin蛋白的表达情况;6、制备小鼠的心肌梗死模型及各组小鼠分组情况;选用spf级野生型和转基因型c57bl/6雄性小鼠(周龄为6-8周、体重为18-24g),随机分为:(1)野生型假手术组(wt+sham)20只;(2)野生型手术组(wt+mi)30只;(3)转基因型假手术组(tg+sham)20只;(4)转基因型手术组(tg+mi)28只。通过结扎左冠状动脉前降支的方法构建心肌梗死模型。手术组为结扎左冠状动脉前降支;而假手术组不结扎左冠状动脉前降支,其余操作同手术组。术后各组小鼠均正常饮食、饮水,连续喂养21天,检测以下各项指标。7、造模后连续观察21天,计算各组小鼠的生存率;8、采用多道生理记录仪测量造模21天后各组小鼠的血流动力学情况;小鼠麻醉后行右颈动脉插管,记录介入颈动脉收缩压(sbp)、舒张压(dbp)和平均动脉压(map);插管进入左心室后记录心室压力变化曲线,根据labchart7.0分析出左室收缩末压(lvesp)、左室舒张末压(lvedp)和最大及最小左室压力变化率(?dp/dtmax)。9、使用电子称称量造模21天后各组小鼠及心脏的重量,计算心脏重量指数(心脏重量/体重)及观察心脏大体形态;10、采用evansblue染色比较造模24小时后各组小鼠心肌梗死情况,采用he染色比较造模21天后各组小鼠心肌梗死情况及室间隔心肌细胞的大小;11、采用masson三色染色比较造模21天后各组小鼠胶原纤维含量及分布情况;12、采用免疫组化法比较造模21天后各组小鼠i型及iii型胶原纤维的含量;13、采用荧光定量试剂盒检测造模21天后各组小鼠钙蛋白酶的活性;14、采用westernblotting法检测造模21天后各组小鼠钙蛋白酶系统(calpain-1、calpain-2、calpastatin)及基质金属蛋白酶系统(mmp-2、mmp-9、tfgβ、timp-1、timp-2)的表达情况。结果:1、将90枚具有活性的注射卵移植至3只假孕母鼠输卵管中,3只母鼠均怀孕,移植成功率为100%;共产下23只小鼠,经pcr鉴定后,2只小鼠为转基因阳性的首建小鼠,阳性率为9%。2、同期的野生型小鼠和转基因型小鼠的体重、血糖、血脂无明显差异(p>0.05)。3、转基因型小鼠各组织中calpastatinmrna的表达情况:转基因型小鼠的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、骨骼肌和脑组织中均有calpastatinmrna的表达。4、内源性calpastatinmrna的表达情况:与野生型比较,转基因型小鼠内源性calpastatinmrna的表达量无明显差异(p>0.05)。5、心脏组织中calpastatin蛋白的表达情况:与野生型相比,转基因型小鼠心脏中calpastatin蛋白的表达水平显著升高(p<0.01)。6、造模21天后,生存率观察结果:与野生型相比,转基因型小鼠的生存率无明显差异(p>0.05)。7、造模21天后,血流动力学观察结果:与假手术组比较,手术组小鼠的sbp、dbp、map、lvesp、dp/dtmax、dp/dtmin均显著降低(p<0.01),lvedp显著升高(p<0.01);在手术组中,与野生型比较,转基因型小鼠的sbp、dbp、map、lvesp、dp/dtmax、dp/dtmin升高(p<0.05或p<0.01),lvedp显著降低(p<0.01)。8、造模21天后,心脏重量指数(心脏重量/体重)观察结果:与假手术组比较,手术组小鼠的心脏重量指数显著升高(p<0.01);在手术组中,与野生型相比,转基因型小鼠心脏重量指数显著降低(p<0.01)。9、心肌梗死面积观察结果:心肌梗死24小时后,与野生型相比,转基因型小鼠的心梗面积无明显差异(p>0.05);心肌梗死21天后,与野生型相比,转基因型小鼠的心梗死面积显著降低(p<0.01)。10、造模21天后,组织学及病理学观察结果:与假手术组比较,手术组小鼠的心肌细胞显著肥厚,梗死区、交界区和非梗死区的胶原纤维含量显著增多(p<0.01);在手术组中,与野生型比较,转基因型小鼠的心肌细胞肥厚显著降低,梗死区、交界区和非梗死区的胶原纤维含量显著降低(p<0.01)。类似的,通过免疫组化发现,与假手术组比较,手术组小鼠梗死区、交界区和非梗死区的i型胶原和iii胶原纤维含量显著增多(p<0.01);在手术组中,与野生型比较,转基因型小鼠梗死区、交界区和非梗死区的i型胶原和iii胶原纤维含量显著降低(p<0.01)。11、造模21天后,钙蛋白酶活性情况:与假手术组比较,手术组小鼠的钙蛋白酶活性明显升高(P<0.01);在手术组中,与野生型比较,转基因型小鼠的钙蛋白酶活性明显降低(P<0.01)。12、造模21天后,钙蛋白酶系统及基质金属蛋白酶系统的蛋白表达情况:与假手术组比较,手术组小鼠的calpain-1、calpain-2、MMP-2、MMP-9、TFGβ均显著升高(P<0.01),calpastatin、TIMP-1、TIMP-2均显著降低(P<0.01);在手术组中,与野生型比较,转基因型小鼠的calpain-1、calpain-2、MMP-2、MMP-9、TFGβ均显著降低(P<0.01),calpastatin、TIMP-1、TIMP-2均显著升高(P<0.01)。结论:1、在转基因型小鼠体内,转录外源性人的calpastatin基因不会对小鼠内源性calpastatin基因的表达产生影响。2、转基因型小鼠不会影响小鼠的生长及体内的糖脂代谢。3、心肌梗死后calpains被激活,可能导致基质金属蛋白酶系统的失衡,引起心肌重构的发生。4、Calpastatin可以抑制心肌梗死后calpains的活性,缩小心肌梗死面积、抑制心肌细胞肥大、降低胶原纤维沉积,从而延缓梗死后心肌重构的发生。