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目的:本试验分二个部分:1、设计并构建小鼠Cdc6基因的RNAi真核表达载体pGCsiU6/Neo/GFP/RNAi。通过尾静脉快速注射法将真核表达载体pGCsiU6/Neo/GFP/RNAi转染至小鼠肝细胞中,运用荧光显微镜及RT-PCR方法观察干扰效果。2、通过观察肝切除后小鼠肝细胞中Cdc6表达变化及其对肝细胞增殖和细胞周期的影响来探讨其在肝切除后肝再生的作用。方法:根据GenBank中Cdc6的序列,设计并构建小鼠Cdc6基因的RNAi真核表达载体pGCsiU6/Neo/GFP/RNAi。通过尾静脉将质粒快速注射入小鼠体内,观察其对肝细胞中Cdc6基因表达的影响。以此组小鼠为RNAi组,同时设立空载体组及空白对照组。采用Higgins＆Aderson创建的经典小鼠肝部分切除术模型,即分别于肝左叶、中叶根部结扎切除。在术后0h、6h、12h、24h、72h五个不同的时相点,分离肝细胞。肝细胞分离方法采用肝脏原位匀速加离体循环胶原酶灌注法,得到肝细胞沉淀。通过台盼蓝染色判断测定细胞活性,细胞计数。①用流式细胞法检测各组细胞增殖周期的变化②裂解细胞提取蛋白及RNA,采用Westernblot和RT-PCR方法测定各组细胞的Cdc6蛋白及基因表达情况。③有3H-亮氨酸掺入法检测各组细胞的增殖率。结果:1.经测序验证,Cdc6基因的RNAi真核表达载体的模板序列与设计序列完全正确,成功构建pGCsiU6/Neo/GFP/RNAi干扰质粒。2.通过尾静脉注射法将质粒pGCsiU6/Neo/GFP/RNAi转染到小鼠肝细胞中,经荧光显微镜观察到绿色荧光。3.经过多次实验,平均每只鼠肝可获取1.5×107个肝细胞。经台盼蓝拒染实验测定细胞平均活性为96%。刚刚分离的肝细胞倒置显微镜下观察可见肝细胞呈单个分散状态,呈圆球形,细胞折光性强,接种4 h后肝细胞贴壁、伸展,连接成条索状;24 h后绝大多数肝细胞贴壁,呈扁平状、体积明显增大,连接成岛屿状;48h后肝细胞贴壁牢固,伸展为上皮样,连接成片。分离培养的细胞形态完全符合典型的肝细胞形态特征。4.在空载体组及空白对照组中,肝细胞中Cdc6的含量由6h开始升高,在24h达到高峰（P＜0.01）,72h有所降低;RNAi组Cdc6蛋白的含量在各时相点均表现为低水平表达,在各时相点之间变化趋势也不明显。5.在术后12h、24h、48h和72h时相点,空载体组及空白对照组肝细胞3H-亮氨酸掺入率分别与RNAi组相比较在统计学上有非常显著差异（P＜0.01）。从组内比较看,空白对照组随时间的变化细胞3H-亮氨酸掺入率在持续增加,从术后6h即有变化,24h更为明显,但是24h到72h之间变化较慢,维持在较高水平;空载体组和空白对照组具有相似性变化;而实验组术后3H-亮氨酸掺入率0h-72h一直保持在较低水平,变化不大。6.与RNAi组相比,空载体组与空白对照组G0/G1期细胞逐渐降低,S期细胞明显增加,在术后各个时相点与RNAi组有明显差异（P＜0.05或者P＜0.01）,其高峰在术后24h,72h有明显降低。另外,空载体组和空白对照组相比较,差异无显著性。结论:1.成功构建pGCsiU6/Neo/GFP/RNAi干扰质粒,并通过尾静脉注射法成功将质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/RNAi转染到小鼠肝细胞中。2.小鼠肝部分切除术后早期Cdc6表达增加,由6h开始升高,在24h达到高峰,72h有所降低,提示Cdc6基因在肝切除术后早期即被激活。3.小鼠肝部分切除术后早期即被激活的Cdc6基因可以明显促进肝细胞的蛋白质合成和细胞生长。随着术后时间的延长,肝细胞3H-亮氨酸掺入率在持续增加,从术后6h升高,24h达到高峰,72h开始降低;而转染后的小鼠肝细胞3H-亮氨酸掺入率则变化不大。4.小鼠肝部分切除术后肝细胞明显处于增殖状态,G0/G1期细胞逐渐降低,S期细胞明显增加。而转染后小鼠肝细胞则停滞于G0/G1期,说明这种增殖状态和Cdc6基因在肝部分切除术后早期激活密切相关。也说明Cdc6参与肝细胞周期的启动,是启动肝细胞复制的关键因子。总之,Cdc6基因在肝切除术后早期即被激活,可以同时促进细胞生长和细胞增殖,在肝再生过程中发挥重要作用。深化对此基因以及细胞生长和细胞增殖间关系的研究将进一步丰富肝再生理论。