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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是二十世纪八十年代末发现的一种高度传染性疾病,引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍,以及各种年龄猪(特别是仔猪)的呼吸道疾病。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。在PRRSV的全基因组序列中,Nsp2基因是序列变异最大的基因之一。2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病。经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有Nsp2基因部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的。1将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNASTAR软件分析,参考国内外已经发表的Nsp2基因序列进行比较。经核酸序列分析比对后发现,SC-JX01株Nsp2基因与Genbank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性较高为98.1%-99.1%,氨基酸的相似性为96.3%-98.3%,表明所获得Nsp2基因序列的毒株属高致病性PRRSV型。同时发现共有30个氨基酸缺失,缺少氨基酸分别位于第481、第532-560位。将分离株与分离自不同地区高热病毒株的基因序列相比较,发现全部都具有相同的缺失,这说明引起猪高热病的病原变异不大;与较早期分离的AY150312、AY262352等毒株进行比较,发现缺失部位不同。对SC-JX01株Nsp2基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析,表明与SC-JX01株Nsp2基因氨基酸序列性质一致。该研究补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。2根据高致病性PRRSV Nsp2基因的缺失信息,设计合成一对引物,建立了基于Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV Nsp2变异株的方法。以含有高致病性PRRSV Nsp2基因的pMD-Nsp2质粒为阳性对照构建标准曲线,对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行评价,同时与常规RT-PCR进行了敏感性比较。结果表明,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号,PCR产物经测序证明为目的基因片断;检测线性范围广,在模板为3.15×10~9拷贝～3.15×10~0拷贝间有良好线性关系,相关系数为0.998 355;敏感度高,最低检测限为3.15拷贝;重复性好,组内变异系数为0.38%～2.22%,组间变异系数为1.74%～3.57%。3根据GenBank登录的高致病性PRRSV Nsp2基因序列和TaqMan探针荧光定量分析原理,利用Primer Express 3.0软件设计并合成了一对引物和一条探针,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV Nsp2变异株的方法。利用pMD-Nsp2质粒作为参比模板,对荧光定量RT-PCR的反应条件进行了优化,并对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,同时用建立的检测方法对以定量的10倍系列稀释质粒pMD-Nsp2为标准品进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达3.15拷贝,线性范围为10~9～10~0,达10个数量级;比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对3份不同的标准品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,组内变异系数为0.47%～1.61%,组间变异系数为1.64%～3.89%。用Nsp2-Taqman RT-PCR方法对猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法的检测灵敏度高出常规RT-PCR,与病毒分离检测方法的阳性符合率为100%,准确性达到预期目标,检测所需样本量少,可满足当前高致病性PRRSV Nsp2变异株的诊断需要。4本实验所建立的2种荧光定量RT-PCR方法(Power SYBR Green RT-PCR andTaqMan RT-PCR),具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、重复性好、通量高等优点,且荧光定量RT-PCR以闭管的模式操作,减少了后续步骤污染的可能性,整个PCR检测过程不到2 h。该方法的建立为高致病性PRRSV Nsp2变异株的早期快速诊断、分子流行病学调查等提供了一种新的快速定量检测手段,具有临床实用性。