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流行病调查数据显示肺癌是持续保持全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一，按组织病理分类，在所有肺癌患者中约15%-20%为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，临床中其表现出肿瘤细胞增殖快、易早期转移、瘤内血管密度高、易复发、预后差等临床特点，整体的5年生存率低于7%。
靶向药物治疗、免疫检测点抑制剂治疗是肺癌治疗领域已应用于临床的新进展，但仅对部分、特定亚型的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)有一定效果，且存在继发耐药、亚类筛查指标不明确等问题，而且其对SCLC目前无可靠有效数据发表。相对于NSCLC，SCLC的治疗方案近30年来一直无显著进展，患者总生存期(overall survival，OS)无明显改善。
血管生成(angiogenesis)与多种实体肿瘤的发生、发展、预后等明显相关，针对于这一过程中的关键靶点可开发、设计抗血管生成的肿瘤治疗药物。部分已获批适应症、进入临床应用的抗血管生成治疗方案目前已成为最有前途的肿瘤治疗方法之一。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是内皮细胞特异性有丝分裂原之一，在复繁杂的血管生成过程中功能表现最强，并起重要作用。目前已有多种靶向VEGF的抗肿瘤血管生成治疗药物，但多有益于NSCLC，临床试验中SCLC中的有效性低于前者。而SCLC的新生血管生成更加明显，在持续无显著改善临床结局的新的治疗方案的情况下，临床迫切需要探索开发新的治疗途径。有无新的针对SCLC有效、靶向血管生成的治疗药物，仍是探索的重点方向。
sFlt-1(Soluble Fms-like tyrosine kinase-1)即可溶性Flt-1，是VEGF受体1(VEGFR-1)的细胞膜外部结构部分，酪氨酸激酶家族的跨膜受体，是一种强效的VEGF内源性选择性抑制剂，与VEGF具有同样高的亲和性。但由于其缺乏跨膜和膜内部分而不能进行膜内的信息传导，从而可阻止细胞内生物学信号的启动。既往研究已证实sFlt-1具有通过抑制多种肿瘤血管生成的机制来发挥抗肿瘤的作用。
外泌体(exosome )是一种可由多种细胞分泌并释放入血的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，内涵多种源于分泌细胞的信息物质，参与体内的信号传导、物质转运、远程靶向调控。在NSCLC及其它实体瘤、非肿瘤性疾病中的作用机制已有较多探索研究，在肿瘤类疾病相关的研究中，其被认为是潜在的生物标志物、治疗靶点或治疗药物的运载工具，有可能成为肿瘤治疗新的途径。其可以被设计成运载工具，将蛋白质、脂质和核酸(DNA、mRNA和miRNA)等功能生物分子转移到靶细胞，从而影响其炎症反应、凋亡或血管生成等生命过程。
在此背景下，我们第一步拟探索建立SCLC来源的外泌体的研究模型工具，并对其分离的外泌体进行验证，为后续进一步的研究提供方法、模型工具。在此基础上，将进一步探索SCLC来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖、迁移、凋亡等的影响，探索外泌体在SCLC的生长、转移中的可能机制。最后我们将验证sFlt-1是否具有抗血管生成作用，制作、验证sFlt-1富集及敲低的外泌体模型工具，研究能否利用外泌体作为其载体作用于靶细胞，对SCLC发挥更强的抗血管生成作用而用于其治疗。通过上述研究拟探索SCLC新的抗血管生成治疗方案，期待改变目前SCLC亟待改善的治疗囧局。
第一章小细胞肺癌细胞系外泌体模型的构建及其鉴定、评估研究
目的:
既往肺癌外泌体研究中SCLC外泌体相关的研究较少，其在该类型肺癌中血管生成中的作用机制、能否成为有效治疗途径仍有待阐明。我们首先尝试构建小细胞肺癌外泌体的细胞学模型工具及分离途径，并对分离外泌体形态、功能、分子标志进行研究评估，作为后续研究的基础。
材料与方法：
1.选取细胞系BEAS-2B、NCI-H69、DMS153、SHP-77作为研究模型，按照提供商的说明要求对细胞进行复苏、传代培养、冻存等，对培养后的细胞悬液给予RNA提取，RT-qPCR检测几种细胞系sFlt-1的mRNA水平，评估几个细胞系中sFlt-1的表达量。
2.对培液使用ExoQuick-TC试剂盒(System Bioscience, Palo Alto, CA, USA)从培养基中分离出外泌体。采用三种不同的方法：透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)和蛋白质印迹分析(western blot analysis)来研究细胞源性外泌体的特征。
结果：
1.RT-qPCR检测几种培养的细胞系sFlt-1的mRNA水平：人正常肺上皮细胞BEAS-2B中sFlt-1的mRNA表达量显著高于小细胞肺癌细胞系DMS153、NCI-H69、SHP-77中sFlt-1的mRNA表达量，其中NCI-H69细胞系中sFlt-1的mRNA表达量相对较低(*p＜0.05，图1.1)。
2.经过ExoQuick-TC试剂盒分离外泌体后，通过Westernblot分析，在NCI-H69-exo、DMS153-exo、SHP-77-exo及BEAS-2B-exo中均证实了外泌体特异性标记CD63、CD9、CD81的表达，图1.2)。
3.透射电子显微镜(TEM)观察外泌体的形态分析显示：重点研究的NCI-H69外泌体(NCI-H69-exo )和BEAS-2B外泌体(BEAS-2B-exo )呈现出典型的有膜结构样颗粒，其囊泡外周的结构中，可见其膜性结构部分，呈杯状外观，直径在30-150nm之间(图1.3A)。
4.NTA分析：NCI-H69-exo、BEAS-2B-exo粒径分布图均程单峰性，约30-150nm之间，浓度为(1.2±1.5)×1011particles/mL(图1.3B)。
上述结果证实了选择的小细胞肺癌细胞系和BEAS-2B细胞均可见sFlt-1的表达，并验证了外泌体的成功分离。
结论:
细胞系BEAS-2B、NCI-H69、DMS153、SHP-77的培养液中均能够提取出sFlt-1mRNA，其中SCLC细胞系中其表达低于BEAS-2B。经Westernblot分析鉴定，分离的外泌体中均可见特异性的分子标志物表达。TEM、NTA进一步验证了NCI-H69-exo、BEAS-2B-exo的形态学特征。实验证实，ExoQuick-TC试剂盒可成功分离培养细胞的外泌体。
此模型可作为小细胞肺癌外泌体的分离的模型，以此为基础可进一步对sFlt-1及SCLC外泌体进行探索研究，以期探索SCLC新的治疗途径。
第二章小细胞肺癌外泌体对内皮细胞增殖、迁移影响的研究
目的:
经上述外泌体分离模型研究的基础上，我们选择代表性的NCI-H69-exo及对照组BEAS-2B-exo作用于HUVECs。通过细胞增殖实验、转板迁移测定、体内基质胶栓实验等方法，探索外泌体对HUVECs的细胞增殖、迁移等是否有影响，并进一步研究体内条件下，两者对新生血管的生成影响是否有差异。进一步研究SCLC外泌体的作用机制，探索SCLC新的潜在治疗靶点。
材料与方法:
1.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)通过标准的胶原酶消化分离，并保存于内皮细胞培养基(ECM, ScienCell, USA)中，添加5%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素(P/S)和1%内皮细胞生长添加剂(ECGS)。
2.用不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)的NCI-H69-exo和BEAS-2B-exo与HUVECs共培养48小时，1%牛血清蛋白(1%BSA)作为阴性对照，经用CCK-8(cell counting kit-8)试剂(Dojingdo Molecular Technology, Japan)检测HUVECs增殖情况。
3.经Transwell实验，采用孔径为8.0μm的改进膜系统(Costar；Corning， NY，USA)评价HUVECs的迁移能力。
4.将等量的NCI-H69-exo和BEAS-2B-exo低温下的低生长因子基质凝胶(350μl,BDBiosciences)混合，将混合物采用皮下注射方法至无胸腺裸鼠中(雄性，6周大，BALB/c)，处死裸鼠将基质胶塞收获，并固定在4%甲醛磷酸盐缓冲液中进行组织学分析。对石蜡切片进行免疫组化分析，读取CD31阳性OD值，评价新生血管情况。
结果:
1.分别采用NCI-H69-exo、BEAS-2B-exo组经Dil染料标记外泌体后与HUVECs共培养，经荧光显微镜观察两组HUVECs可纳入两者的外泌体，且纳入外泌体后两组的存活情况未受影响(图2.1A)。
2.细胞增殖试验用CCK-8(cell counting kit-8)试剂检测HUVECs增殖情况试验中，HUVECs分别与不同外泌体浓度组NCI-H69-exo(25、50、100μg/ml)，BEAS-2B-exo(25、50、100μg/ml)，1%BSA(阴性对照组)共培养48h后，用CCK-8法分析HUVECs增殖情况。在100μg/ml时，与BEAS-2Bexo对比，NCI-H69-exo促进HUVEC的增殖更明显(*p<0.05，图2.1B)。
3.转板迁移实验(transwell migration assay)中，与BEAS-2B-exo(100μg/ml)相比，NCI-H69-exo增加了HUVECs的迁移(*p<0.05，图2.1C)。
4.基质凝胶塞法对裸鼠的血管形成进行了评价，经过13天后，处死裸鼠将基质胶塞收获，经石蜡切片、组织病理分析血管密度OD值，与BEAS-2B-exo相比，NCI-H69-exo显著增加了凝胶栓塞中新生血管的密度(*p<0.05，图2.1D)。
这些数据表明，来自SCLC细胞的外泌体在一定浓度下可促进细胞的增殖，并可增加细胞迁移、促进血管生成。
结论:
与BEAS-2B-exo相比，NCI-H69-exo增加了HUVECs的增殖、迁移，NCI-H69-exo可增加体内胶质栓子的新生血管的密度。
这些数据表明，来源于SCLC细胞的外泌体通过增强HUVECs的增殖、迁移促进新生血管生成，为肿瘤细胞的生长、转移提供基础。
第三章sFlt-1富集的外泌体通过抑制内皮细胞的迁移抑制小细胞肺癌生长的研究
目的:
在上述两个实验的基础上，首先探索sFlt-1在临床SCLC患者血清外泌体中的表达情况，并通过Transwell迁移实验验证sFlt-1蛋白及NCI-H69外泌体对HUVECs迁移的影响。进一步构建sFlt-1过表达的细胞模型，探索富集后的sFlt-1外泌体是否具有更进一步的抑制HUVECs迁移作用，然后再敲低sFlt-1的表达观察上述作用。并进行动物实验，在小鼠体内探讨sFlt-1及sFlt-1富集后的外泌体对SCLC细胞系移植瘤是否具有治疗作用。
材料与方法:
1.我们通过临床血清样本对比SCLC与健康体检者血清外泌体中sFlt-1的水平，并对BEAS-2B、NCI-H69外泌体中sFlt-1的水平进行测定，对外泌体中sFlt-1进行初步研究。
2.通过对HUVECs的作用，验证sFlt-1蛋白、NCI-H69外泌体中sFlt-1对其迁移的作用。
3.通过慢病毒过转载sFlt-1基因至HEK293细胞构建sFlt-1的过表达模型，.通过过表达稳转细胞系获得富集sFlt-1的外泌体，进一步探索其对HUVECs的作用。
4.敲低NCI-H69sFlt-1的表达后，再次研究其对内皮细胞凋亡、增殖、迁移等的影响。
5.通过构建小鼠体内移植瘤的模型，研究过表达的外泌体在体内是否具有抗SCLC的作用及其机制。
结果:
1.血清外泌体及不同细胞系外泌体中sFlt-1表达情况：
正常体检患者血清外泌体(normal-serum-exo)sFlt-1的水平明显高于SCLC患者(SCLC-serum-exo )。BEAS-2B-exo中sFlt-1蛋白的表达也明显高于NCI-H69-exo(*p<0.05，图3.1)。
2.sFlt-1蛋白及含sFlt-1的外泌体对HUCECs的影响：
将对照组(0.5%FBS)、实验组(0.5%FBS+sFlt-1，500ng/ml)分别处理HUVEC细胞，之后进行Transwell实验。实验组细胞迁移数明显低于对照组，提示加入的sFlt-1蛋白较对照组单纯FBS时可抑制HUVECs细胞的迁移。NCI-H69-exo(100μg/ml)与NCI-H69-exo(100μg/ml)+sFlt-1蛋白(500ng/ml)分别处理HUVEC细胞，进行Transwell实验，后者细胞迁移能力明显降低(*p<0.05，图3.2)。
3.构建sFlt-1过表达模型，研究过表达外泌体对HUVECs的影响：
构建过表达模型及验证、评估：通过将HEK293细胞感染表达Tet-sFlt-1的慢病毒，获得过表达sFlt-1的稳转细胞株，并提取外泌体。经过Westernblot检测过表达细胞系外泌体中sFlt-1表达量明显高于对照组，同时RT-qPCR法检测mRNA水平的相对表达量也是高于对照组，证实过表达sFlt-1HEK-293稳转细胞系构建成功(*p<0.05，图3.3)。后续鉴定从过表达细胞系分离出的外泌体特征，验证外泌体的正确分离(图3.4)。
过表达模型外泌体对对HUVECs的增殖、凋亡的影响：CCK-8检测HUVECs增殖情况，过表达组(OV-sFlt-1 )的增殖活性显著低于对照细胞(*p<0.05，图3.5)。经流式细胞仪检测提示，OV-HEK293-sFlt-1-exo组处理的HUVECs凋亡率明显高于对照组(*p<0.05，图3.6)。
过表达模型外泌体对对HUVECs的迁移的影响：再分别以过表达sFlt-1组(OV-HEK293-exo)、对照组NC-HEK293-exo分别处理HUVECs细胞，经划痕实验，OV-HEK293-exo组作用后的HUVECs细胞迁移数明显少于对照组NCI-H69-exo(*p<0.05，图3.7)。
进一步采用Transwell迁移实验，采用sFlt-1蛋白(500ng/ml)+NCI-H69-exo共同作用于HUVECs，相较于单独的NCI-H69-exo组，联合蛋白组(NCI-H69-exo+sFlt-1)中HUVECs迁移减少，提示sFlt-1具有抑制HUVECs迁移、抑制血管生成的作用。过表达sFlt-1的OV-HEK293sFlt-1-exo联合NCI-H69-exo作用于HUVECs，联合sFlt-1外泌体组较蛋白组HUVECs的迁移数进一步减少(*p<0.05，图3.8)。
4.敲低NCI-H69sFlt-1表达，研究其外泌体对HUVECs的影响：
三条制作的siRNA(Si-sFlt-1#1, Si-sFlt-1#2, Si-sFlt-1#3)构建于NCI-H69细胞后，qPCR分析三条siRNA都能够在mRNA水平敲低sFlt-1，选取Si-sFlt-1#3敲低效率较高组进行对HUVECs的影响研究(图3.9)。通过CCK-8检测、流式细胞仪、划痕试验检测，结果提示：敲低表达外泌体组(si-NCIH69-sFlt1-exo)与对照组在OD值、细胞凋亡率等方面与对照组差异未见显著性(#p＞0.05，图3.10、图3.11)，但划痕实验结果HUVECs迁移能力增强(*p<0.05，图3.12)。
5.动物实验：
过表达sFlt-1的外泌体(OV-HEK293-exo)治疗后的小鼠的肿瘤重量平均较阴性对照组下降了66%。sFlt-1外泌体显示出明显可抑制NCI-H69肿瘤异种移植物的生长，显示出明显的抗肿瘤活性(图3.13A-C)。移植瘤病理检测：CD31染色显示OV-HEK293-exo治疗后的瘤体组织内肿瘤微血管密度较对照组明显降低。Ki67染色后，OV-HEK293-exo治疗后的组织内瘤体Ki67表达量较对照组降低，提示肿瘤细胞的增殖速度降低。TUNEL染色显示：OV-HEK293-exo治疗后的瘤体组织内阳性显色细胞数较对照组升高，提示实验组治疗后细胞凋亡数高于对照组(图3.13D)。
结论:
1.SCLC患者及其细胞系中sFlt-1的表达量减少；
2.sFlt-1蛋白可抑制HUVECs的迁移能力，逆转SCLC-exo对HUVECs的迁移作用；包含sFlt-1的外泌体较单纯的sFlt-1蛋白组抑制迁移能力更强。
3.搭载sFlt-1基因片段的慢病毒可以高效转染HEK293细胞，并成功产生sFlt-1的过表达模型。过表达产生的sFlt-1外泌体可转移至HUVECs中抑制其迁移，发挥抗血管生成作用。
4.敲低sFlt-1的表达后，在所研究的NCI-H69细胞系中，低表达sFlt-1组对HUVECs的增殖、凋亡方面未见统计学差异，但迁移增加。
5.动物实验提示：富集sFlt-1后的外泌体，可降低瘤体内血管密度，促进瘤体内细胞的凋亡，抑制细胞的增值。
sFlt-1及其外泌体装载模式可被认为是一种潜在有效的治疗SCLC的途径。
总结
小细胞肺癌患者血清及细胞系培养液可经过ExoQuick-TC分离外泌体，正常人血清及支气管内皮细胞外泌体中sFlt-1的表达量高于恶性患者及细胞系。相对于BEAS-2B-exo，NCI-H69-exo可增加HUVECs的迁移。
sFlt-1蛋白或sFlt-1富集的外泌体可抑制HUVECs的迁移，敲低后其迁移增加。与相同浓度的sFlt-1蛋白相比，sFlt-1富集的外泌体抑制作用更强。富集sFlt-1的外泌体可抑制NCI-H69肿瘤异种移植的生长，显示出明显的抗肿瘤活性，其瘤体内血管密度降低、细胞增殖降低，细胞凋亡增加。
综上，sFlt-1富集的外泌体可作为SCLC的潜在有效治疗模式，后续可进一步对其机制及影响因素进行探索。
靶向药物治疗、免疫检测点抑制剂治疗是肺癌治疗领域已应用于临床的新进展，但仅对部分、特定亚型的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)有一定效果，且存在继发耐药、亚类筛查指标不明确等问题，而且其对SCLC目前无可靠有效数据发表。相对于NSCLC，SCLC的治疗方案近30年来一直无显著进展，患者总生存期(overall survival，OS)无明显改善。
血管生成(angiogenesis)与多种实体肿瘤的发生、发展、预后等明显相关，针对于这一过程中的关键靶点可开发、设计抗血管生成的肿瘤治疗药物。部分已获批适应症、进入临床应用的抗血管生成治疗方案目前已成为最有前途的肿瘤治疗方法之一。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是内皮细胞特异性有丝分裂原之一，在复繁杂的血管生成过程中功能表现最强，并起重要作用。目前已有多种靶向VEGF的抗肿瘤血管生成治疗药物，但多有益于NSCLC，临床试验中SCLC中的有效性低于前者。而SCLC的新生血管生成更加明显，在持续无显著改善临床结局的新的治疗方案的情况下，临床迫切需要探索开发新的治疗途径。有无新的针对SCLC有效、靶向血管生成的治疗药物，仍是探索的重点方向。
sFlt-1(Soluble Fms-like tyrosine kinase-1)即可溶性Flt-1，是VEGF受体1(VEGFR-1)的细胞膜外部结构部分，酪氨酸激酶家族的跨膜受体，是一种强效的VEGF内源性选择性抑制剂，与VEGF具有同样高的亲和性。但由于其缺乏跨膜和膜内部分而不能进行膜内的信息传导，从而可阻止细胞内生物学信号的启动。既往研究已证实sFlt-1具有通过抑制多种肿瘤血管生成的机制来发挥抗肿瘤的作用。
外泌体(exosome )是一种可由多种细胞分泌并释放入血的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，内涵多种源于分泌细胞的信息物质，参与体内的信号传导、物质转运、远程靶向调控。在NSCLC及其它实体瘤、非肿瘤性疾病中的作用机制已有较多探索研究，在肿瘤类疾病相关的研究中，其被认为是潜在的生物标志物、治疗靶点或治疗药物的运载工具，有可能成为肿瘤治疗新的途径。其可以被设计成运载工具，将蛋白质、脂质和核酸(DNA、mRNA和miRNA)等功能生物分子转移到靶细胞，从而影响其炎症反应、凋亡或血管生成等生命过程。
在此背景下，我们第一步拟探索建立SCLC来源的外泌体的研究模型工具，并对其分离的外泌体进行验证，为后续进一步的研究提供方法、模型工具。在此基础上，将进一步探索SCLC来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖、迁移、凋亡等的影响，探索外泌体在SCLC的生长、转移中的可能机制。最后我们将验证sFlt-1是否具有抗血管生成作用，制作、验证sFlt-1富集及敲低的外泌体模型工具，研究能否利用外泌体作为其载体作用于靶细胞，对SCLC发挥更强的抗血管生成作用而用于其治疗。通过上述研究拟探索SCLC新的抗血管生成治疗方案，期待改变目前SCLC亟待改善的治疗囧局。
第一章小细胞肺癌细胞系外泌体模型的构建及其鉴定、评估研究
目的:
既往肺癌外泌体研究中SCLC外泌体相关的研究较少，其在该类型肺癌中血管生成中的作用机制、能否成为有效治疗途径仍有待阐明。我们首先尝试构建小细胞肺癌外泌体的细胞学模型工具及分离途径，并对分离外泌体形态、功能、分子标志进行研究评估，作为后续研究的基础。
材料与方法：
1.选取细胞系BEAS-2B、NCI-H69、DMS153、SHP-77作为研究模型，按照提供商的说明要求对细胞进行复苏、传代培养、冻存等，对培养后的细胞悬液给予RNA提取，RT-qPCR检测几种细胞系sFlt-1的mRNA水平，评估几个细胞系中sFlt-1的表达量。
2.对培液使用ExoQuick-TC试剂盒(System Bioscience, Palo Alto, CA, USA)从培养基中分离出外泌体。采用三种不同的方法：透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)和蛋白质印迹分析(western blot analysis)来研究细胞源性外泌体的特征。
结果：
1.RT-qPCR检测几种培养的细胞系sFlt-1的mRNA水平：人正常肺上皮细胞BEAS-2B中sFlt-1的mRNA表达量显著高于小细胞肺癌细胞系DMS153、NCI-H69、SHP-77中sFlt-1的mRNA表达量，其中NCI-H69细胞系中sFlt-1的mRNA表达量相对较低(*p＜0.05，图1.1)。
2.经过ExoQuick-TC试剂盒分离外泌体后，通过Westernblot分析，在NCI-H69-exo、DMS153-exo、SHP-77-exo及BEAS-2B-exo中均证实了外泌体特异性标记CD63、CD9、CD81的表达，图1.2)。
3.透射电子显微镜(TEM)观察外泌体的形态分析显示：重点研究的NCI-H69外泌体(NCI-H69-exo )和BEAS-2B外泌体(BEAS-2B-exo )呈现出典型的有膜结构样颗粒，其囊泡外周的结构中，可见其膜性结构部分，呈杯状外观，直径在30-150nm之间(图1.3A)。
4.NTA分析：NCI-H69-exo、BEAS-2B-exo粒径分布图均程单峰性，约30-150nm之间，浓度为(1.2±1.5)×1011particles/mL(图1.3B)。
上述结果证实了选择的小细胞肺癌细胞系和BEAS-2B细胞均可见sFlt-1的表达，并验证了外泌体的成功分离。
结论:
细胞系BEAS-2B、NCI-H69、DMS153、SHP-77的培养液中均能够提取出sFlt-1mRNA，其中SCLC细胞系中其表达低于BEAS-2B。经Westernblot分析鉴定，分离的外泌体中均可见特异性的分子标志物表达。TEM、NTA进一步验证了NCI-H69-exo、BEAS-2B-exo的形态学特征。实验证实，ExoQuick-TC试剂盒可成功分离培养细胞的外泌体。
此模型可作为小细胞肺癌外泌体的分离的模型，以此为基础可进一步对sFlt-1及SCLC外泌体进行探索研究，以期探索SCLC新的治疗途径。
第二章小细胞肺癌外泌体对内皮细胞增殖、迁移影响的研究
目的:
经上述外泌体分离模型研究的基础上，我们选择代表性的NCI-H69-exo及对照组BEAS-2B-exo作用于HUVECs。通过细胞增殖实验、转板迁移测定、体内基质胶栓实验等方法，探索外泌体对HUVECs的细胞增殖、迁移等是否有影响，并进一步研究体内条件下，两者对新生血管的生成影响是否有差异。进一步研究SCLC外泌体的作用机制，探索SCLC新的潜在治疗靶点。
材料与方法:
1.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)通过标准的胶原酶消化分离，并保存于内皮细胞培养基(ECM, ScienCell, USA)中，添加5%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素(P/S)和1%内皮细胞生长添加剂(ECGS)。
2.用不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)的NCI-H69-exo和BEAS-2B-exo与HUVECs共培养48小时，1%牛血清蛋白(1%BSA)作为阴性对照，经用CCK-8(cell counting kit-8)试剂(Dojingdo Molecular Technology, Japan)检测HUVECs增殖情况。
3.经Transwell实验，采用孔径为8.0μm的改进膜系统(Costar；Corning， NY，USA)评价HUVECs的迁移能力。
4.将等量的NCI-H69-exo和BEAS-2B-exo低温下的低生长因子基质凝胶(350μl,BDBiosciences)混合，将混合物采用皮下注射方法至无胸腺裸鼠中(雄性，6周大，BALB/c)，处死裸鼠将基质胶塞收获，并固定在4%甲醛磷酸盐缓冲液中进行组织学分析。对石蜡切片进行免疫组化分析，读取CD31阳性OD值，评价新生血管情况。
结果:
1.分别采用NCI-H69-exo、BEAS-2B-exo组经Dil染料标记外泌体后与HUVECs共培养，经荧光显微镜观察两组HUVECs可纳入两者的外泌体，且纳入外泌体后两组的存活情况未受影响(图2.1A)。
2.细胞增殖试验用CCK-8(cell counting kit-8)试剂检测HUVECs增殖情况试验中，HUVECs分别与不同外泌体浓度组NCI-H69-exo(25、50、100μg/ml)，BEAS-2B-exo(25、50、100μg/ml)，1%BSA(阴性对照组)共培养48h后，用CCK-8法分析HUVECs增殖情况。在100μg/ml时，与BEAS-2Bexo对比，NCI-H69-exo促进HUVEC的增殖更明显(*p<0.05，图2.1B)。
3.转板迁移实验(transwell migration assay)中，与BEAS-2B-exo(100μg/ml)相比，NCI-H69-exo增加了HUVECs的迁移(*p<0.05，图2.1C)。
4.基质凝胶塞法对裸鼠的血管形成进行了评价，经过13天后，处死裸鼠将基质胶塞收获，经石蜡切片、组织病理分析血管密度OD值，与BEAS-2B-exo相比，NCI-H69-exo显著增加了凝胶栓塞中新生血管的密度(*p<0.05，图2.1D)。
这些数据表明，来自SCLC细胞的外泌体在一定浓度下可促进细胞的增殖，并可增加细胞迁移、促进血管生成。
结论:
与BEAS-2B-exo相比，NCI-H69-exo增加了HUVECs的增殖、迁移，NCI-H69-exo可增加体内胶质栓子的新生血管的密度。
这些数据表明，来源于SCLC细胞的外泌体通过增强HUVECs的增殖、迁移促进新生血管生成，为肿瘤细胞的生长、转移提供基础。
第三章sFlt-1富集的外泌体通过抑制内皮细胞的迁移抑制小细胞肺癌生长的研究
目的:
在上述两个实验的基础上，首先探索sFlt-1在临床SCLC患者血清外泌体中的表达情况，并通过Transwell迁移实验验证sFlt-1蛋白及NCI-H69外泌体对HUVECs迁移的影响。进一步构建sFlt-1过表达的细胞模型，探索富集后的sFlt-1外泌体是否具有更进一步的抑制HUVECs迁移作用，然后再敲低sFlt-1的表达观察上述作用。并进行动物实验，在小鼠体内探讨sFlt-1及sFlt-1富集后的外泌体对SCLC细胞系移植瘤是否具有治疗作用。
材料与方法:
1.我们通过临床血清样本对比SCLC与健康体检者血清外泌体中sFlt-1的水平，并对BEAS-2B、NCI-H69外泌体中sFlt-1的水平进行测定，对外泌体中sFlt-1进行初步研究。
2.通过对HUVECs的作用，验证sFlt-1蛋白、NCI-H69外泌体中sFlt-1对其迁移的作用。
3.通过慢病毒过转载sFlt-1基因至HEK293细胞构建sFlt-1的过表达模型，.通过过表达稳转细胞系获得富集sFlt-1的外泌体，进一步探索其对HUVECs的作用。
4.敲低NCI-H69sFlt-1的表达后，再次研究其对内皮细胞凋亡、增殖、迁移等的影响。
5.通过构建小鼠体内移植瘤的模型，研究过表达的外泌体在体内是否具有抗SCLC的作用及其机制。
结果:
1.血清外泌体及不同细胞系外泌体中sFlt-1表达情况：
正常体检患者血清外泌体(normal-serum-exo)sFlt-1的水平明显高于SCLC患者(SCLC-serum-exo )。BEAS-2B-exo中sFlt-1蛋白的表达也明显高于NCI-H69-exo(*p<0.05，图3.1)。
2.sFlt-1蛋白及含sFlt-1的外泌体对HUCECs的影响：
将对照组(0.5%FBS)、实验组(0.5%FBS+sFlt-1，500ng/ml)分别处理HUVEC细胞，之后进行Transwell实验。实验组细胞迁移数明显低于对照组，提示加入的sFlt-1蛋白较对照组单纯FBS时可抑制HUVECs细胞的迁移。NCI-H69-exo(100μg/ml)与NCI-H69-exo(100μg/ml)+sFlt-1蛋白(500ng/ml)分别处理HUVEC细胞，进行Transwell实验，后者细胞迁移能力明显降低(*p<0.05，图3.2)。
3.构建sFlt-1过表达模型，研究过表达外泌体对HUVECs的影响：
构建过表达模型及验证、评估：通过将HEK293细胞感染表达Tet-sFlt-1的慢病毒，获得过表达sFlt-1的稳转细胞株，并提取外泌体。经过Westernblot检测过表达细胞系外泌体中sFlt-1表达量明显高于对照组，同时RT-qPCR法检测mRNA水平的相对表达量也是高于对照组，证实过表达sFlt-1HEK-293稳转细胞系构建成功(*p<0.05，图3.3)。后续鉴定从过表达细胞系分离出的外泌体特征，验证外泌体的正确分离(图3.4)。
过表达模型外泌体对对HUVECs的增殖、凋亡的影响：CCK-8检测HUVECs增殖情况，过表达组(OV-sFlt-1 )的增殖活性显著低于对照细胞(*p<0.05，图3.5)。经流式细胞仪检测提示，OV-HEK293-sFlt-1-exo组处理的HUVECs凋亡率明显高于对照组(*p<0.05，图3.6)。
过表达模型外泌体对对HUVECs的迁移的影响：再分别以过表达sFlt-1组(OV-HEK293-exo)、对照组NC-HEK293-exo分别处理HUVECs细胞，经划痕实验，OV-HEK293-exo组作用后的HUVECs细胞迁移数明显少于对照组NCI-H69-exo(*p<0.05，图3.7)。
进一步采用Transwell迁移实验，采用sFlt-1蛋白(500ng/ml)+NCI-H69-exo共同作用于HUVECs，相较于单独的NCI-H69-exo组，联合蛋白组(NCI-H69-exo+sFlt-1)中HUVECs迁移减少，提示sFlt-1具有抑制HUVECs迁移、抑制血管生成的作用。过表达sFlt-1的OV-HEK293sFlt-1-exo联合NCI-H69-exo作用于HUVECs，联合sFlt-1外泌体组较蛋白组HUVECs的迁移数进一步减少(*p<0.05，图3.8)。
4.敲低NCI-H69sFlt-1表达，研究其外泌体对HUVECs的影响：
三条制作的siRNA(Si-sFlt-1#1, Si-sFlt-1#2, Si-sFlt-1#3)构建于NCI-H69细胞后，qPCR分析三条siRNA都能够在mRNA水平敲低sFlt-1，选取Si-sFlt-1#3敲低效率较高组进行对HUVECs的影响研究(图3.9)。通过CCK-8检测、流式细胞仪、划痕试验检测，结果提示：敲低表达外泌体组(si-NCIH69-sFlt1-exo)与对照组在OD值、细胞凋亡率等方面与对照组差异未见显著性(#p＞0.05，图3.10、图3.11)，但划痕实验结果HUVECs迁移能力增强(*p<0.05，图3.12)。
5.动物实验：
过表达sFlt-1的外泌体(OV-HEK293-exo)治疗后的小鼠的肿瘤重量平均较阴性对照组下降了66%。sFlt-1外泌体显示出明显可抑制NCI-H69肿瘤异种移植物的生长，显示出明显的抗肿瘤活性(图3.13A-C)。移植瘤病理检测：CD31染色显示OV-HEK293-exo治疗后的瘤体组织内肿瘤微血管密度较对照组明显降低。Ki67染色后，OV-HEK293-exo治疗后的组织内瘤体Ki67表达量较对照组降低，提示肿瘤细胞的增殖速度降低。TUNEL染色显示：OV-HEK293-exo治疗后的瘤体组织内阳性显色细胞数较对照组升高，提示实验组治疗后细胞凋亡数高于对照组(图3.13D)。
结论:
1.SCLC患者及其细胞系中sFlt-1的表达量减少；
2.sFlt-1蛋白可抑制HUVECs的迁移能力，逆转SCLC-exo对HUVECs的迁移作用；包含sFlt-1的外泌体较单纯的sFlt-1蛋白组抑制迁移能力更强。
3.搭载sFlt-1基因片段的慢病毒可以高效转染HEK293细胞，并成功产生sFlt-1的过表达模型。过表达产生的sFlt-1外泌体可转移至HUVECs中抑制其迁移，发挥抗血管生成作用。
4.敲低sFlt-1的表达后，在所研究的NCI-H69细胞系中，低表达sFlt-1组对HUVECs的增殖、凋亡方面未见统计学差异，但迁移增加。
5.动物实验提示：富集sFlt-1后的外泌体，可降低瘤体内血管密度，促进瘤体内细胞的凋亡，抑制细胞的增值。
sFlt-1及其外泌体装载模式可被认为是一种潜在有效的治疗SCLC的途径。
总结
小细胞肺癌患者血清及细胞系培养液可经过ExoQuick-TC分离外泌体，正常人血清及支气管内皮细胞外泌体中sFlt-1的表达量高于恶性患者及细胞系。相对于BEAS-2B-exo，NCI-H69-exo可增加HUVECs的迁移。
sFlt-1蛋白或sFlt-1富集的外泌体可抑制HUVECs的迁移，敲低后其迁移增加。与相同浓度的sFlt-1蛋白相比，sFlt-1富集的外泌体抑制作用更强。富集sFlt-1的外泌体可抑制NCI-H69肿瘤异种移植的生长，显示出明显的抗肿瘤活性，其瘤体内血管密度降低、细胞增殖降低，细胞凋亡增加。
综上，sFlt-1富集的外泌体可作为SCLC的潜在有效治疗模式，后续可进一步对其机制及影响因素进行探索。