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【目的】
1.检测IlamycinC在三阴乳腺癌细胞株、非三阴乳腺癌细胞株以及正常乳腺上皮细胞株中的细胞毒活性；
2.研究IlamycinC抑制三阴乳腺癌的功能；
3.研究IlamycinC抑制三阴乳腺癌的机制。
【方法】
采用CCK-8实验确定IlamycinC对三阴乳腺癌细胞株、非三阴乳腺癌细胞株MCF7、以及正常乳腺上皮细胞株MCF10A的细胞毒活性和IC50值，通过EdU荧光染色实验和流式细胞术确定IlamycinC对三阴乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响，利用Transwell实验确定IlamycinC对三阴乳腺癌侵袭、转移功能的影响，通过siRNA敲低实验和慢病毒过表达实验和westernblot实验确定Ilamycin抗三阴乳腺癌的作用机制。
【结果】
1.非三阴乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞相比，IlamycinC对三阴乳腺癌细胞具有较强的选择性细胞毒活性。研究发现，IlamycinC对非三阴乳腺癌细胞MCF7的IC50值为15.93μmol/L，对正常乳腺上皮细胞MCF10A的IC50值为35.53μmol/L，而IlamycinC对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549的IC50值分别为7.26μmol/L和6.91μmol/L，该差异具有统计学意义，表明IlamycinC对三阴乳腺癌细胞具有较强的选择性细胞毒活性。此外，与临床常用化疗药物阿霉素和顺铂相比，阿霉素对三阴乳腺癌细胞和非三阴乳腺癌细胞的细胞毒活性的差异无统计学意义，顺铂对非三阴乳腺癌细胞的细胞毒活性较强，而IlamycinC针对三阴乳腺癌的细胞毒活性具有较好的选择性。
2.IlamycinC能够抑制三阴乳腺癌的增殖。用IlamycinC分别处理MDA-MB-231和BT-54924h后，发现在IlamycinC浓度为6μmol/L的处理组中，EdU染色阳性的细胞明显减少，证实了IlamycinC可以抑制三阴乳腺癌细胞的增殖。
3.IlamycinC能够诱导三阴乳腺癌的凋亡。流式细胞术的结果发现，在IlamycinC浓度为6μmol/L的处理组中，MDA-MB-231和BT-549在12h后就会发生凋亡，而在24h后，凋亡率增加更加明显。针对凋亡相关的caspase家族依赖通路蛋白的westernblot实验结果证实了IlamycinC可以诱导三阴乳腺癌细胞的凋亡。
4.IlamycinC能够有效抑制三阴乳腺癌的侵袭和转移。通过transwell转移实验和基质胶侵袭实验，发现IlamycinC处理24h后，MDA-MB-231和BT-549细胞的侵袭和转移能力明显随着IlamycinC浓度的增加而降低。针对影响侵袭和转移的关键蛋白MMP家族、vimentin和fascin的westernblot实验结果证实了IlamycinC可有效抑制三阴乳腺癌细胞的侵袭和转移。
5.IlamycinC通过抑制IL-6/STAT3通路发挥抗三阴乳腺癌作用。在IlamycinC处理MDA-MB-231和BT-549细胞24h后，p-JAK2和p-STAT3的表达水平明显下降，而总的JAK2和STAT3却无明显变化。同时，我们还发现IlamycinC可通过抑制STAT3的磷酸化而导致入核的p-STAT3蛋白水平减少。而在IlamycinC处理MDA-MB-231和BT-549细胞24h后，再加入50ng/mL的IL-6，发现IlamycinC可以抑制IL-6激活的STAT3的磷酸化通路。
6.过表达STAT3可回复IlamycinC对三阴乳腺癌的凋亡、转移和侵袭的调控。采用慢病毒构建MDA-MB-231和BT-549过表达STAT3稳转细胞株，然后加入IlamycinC处理24h，发现IL-6/STAT3通路及其下游的凋亡、侵袭和转移蛋白的变化均可回复。
7.敲低STAT3可增强IlamycinC对三阴乳腺癌的凋亡、转移和侵袭的调控。利用小干扰RNA在MDA-MB-231和BT-549细胞敲低STAT3。然后加入IlamycinC处理24h，发现IlamycinC处理的敲低STAT3的三阴乳腺癌细胞的IL-6/STAT3通路及其下游的凋亡、侵袭和转移蛋白的变化明显强于未敲低STAT3仅加入IlamycinC处理的三阴乳腺癌细胞。
【结论】
本研究发现与临床药物阿霉素和顺铂相比，IlamycinC对三阴乳腺癌细胞具有良好的选择性细胞毒活性。进一步的研究证实，IlamycinC可以通过抑制IL-6诱导的STAT3的磷酸化而减少三阴乳腺癌细胞核内磷酸化STAT3二聚体的水平，从而可以调控下游的caspase凋亡通路而诱导三阴性乳腺癌细胞的凋亡；同时通过调控转移和侵袭通路而抑制三阴性乳腺癌细胞的转移和侵袭。研究结果表明IlamycinC可以作为IL-6/STAT3通路的新型抑制剂而具有治疗三阴乳腺癌的潜在应用价值。
1.检测IlamycinC在三阴乳腺癌细胞株、非三阴乳腺癌细胞株以及正常乳腺上皮细胞株中的细胞毒活性；
2.研究IlamycinC抑制三阴乳腺癌的功能；
3.研究IlamycinC抑制三阴乳腺癌的机制。
【方法】
采用CCK-8实验确定IlamycinC对三阴乳腺癌细胞株、非三阴乳腺癌细胞株MCF7、以及正常乳腺上皮细胞株MCF10A的细胞毒活性和IC50值，通过EdU荧光染色实验和流式细胞术确定IlamycinC对三阴乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响，利用Transwell实验确定IlamycinC对三阴乳腺癌侵袭、转移功能的影响，通过siRNA敲低实验和慢病毒过表达实验和westernblot实验确定Ilamycin抗三阴乳腺癌的作用机制。
【结果】
1.非三阴乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞相比，IlamycinC对三阴乳腺癌细胞具有较强的选择性细胞毒活性。研究发现，IlamycinC对非三阴乳腺癌细胞MCF7的IC50值为15.93μmol/L，对正常乳腺上皮细胞MCF10A的IC50值为35.53μmol/L，而IlamycinC对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549的IC50值分别为7.26μmol/L和6.91μmol/L，该差异具有统计学意义，表明IlamycinC对三阴乳腺癌细胞具有较强的选择性细胞毒活性。此外，与临床常用化疗药物阿霉素和顺铂相比，阿霉素对三阴乳腺癌细胞和非三阴乳腺癌细胞的细胞毒活性的差异无统计学意义，顺铂对非三阴乳腺癌细胞的细胞毒活性较强，而IlamycinC针对三阴乳腺癌的细胞毒活性具有较好的选择性。
2.IlamycinC能够抑制三阴乳腺癌的增殖。用IlamycinC分别处理MDA-MB-231和BT-54924h后，发现在IlamycinC浓度为6μmol/L的处理组中，EdU染色阳性的细胞明显减少，证实了IlamycinC可以抑制三阴乳腺癌细胞的增殖。
3.IlamycinC能够诱导三阴乳腺癌的凋亡。流式细胞术的结果发现，在IlamycinC浓度为6μmol/L的处理组中，MDA-MB-231和BT-549在12h后就会发生凋亡，而在24h后，凋亡率增加更加明显。针对凋亡相关的caspase家族依赖通路蛋白的westernblot实验结果证实了IlamycinC可以诱导三阴乳腺癌细胞的凋亡。
4.IlamycinC能够有效抑制三阴乳腺癌的侵袭和转移。通过transwell转移实验和基质胶侵袭实验，发现IlamycinC处理24h后，MDA-MB-231和BT-549细胞的侵袭和转移能力明显随着IlamycinC浓度的增加而降低。针对影响侵袭和转移的关键蛋白MMP家族、vimentin和fascin的westernblot实验结果证实了IlamycinC可有效抑制三阴乳腺癌细胞的侵袭和转移。
5.IlamycinC通过抑制IL-6/STAT3通路发挥抗三阴乳腺癌作用。在IlamycinC处理MDA-MB-231和BT-549细胞24h后，p-JAK2和p-STAT3的表达水平明显下降，而总的JAK2和STAT3却无明显变化。同时，我们还发现IlamycinC可通过抑制STAT3的磷酸化而导致入核的p-STAT3蛋白水平减少。而在IlamycinC处理MDA-MB-231和BT-549细胞24h后，再加入50ng/mL的IL-6，发现IlamycinC可以抑制IL-6激活的STAT3的磷酸化通路。
6.过表达STAT3可回复IlamycinC对三阴乳腺癌的凋亡、转移和侵袭的调控。采用慢病毒构建MDA-MB-231和BT-549过表达STAT3稳转细胞株，然后加入IlamycinC处理24h，发现IL-6/STAT3通路及其下游的凋亡、侵袭和转移蛋白的变化均可回复。
7.敲低STAT3可增强IlamycinC对三阴乳腺癌的凋亡、转移和侵袭的调控。利用小干扰RNA在MDA-MB-231和BT-549细胞敲低STAT3。然后加入IlamycinC处理24h，发现IlamycinC处理的敲低STAT3的三阴乳腺癌细胞的IL-6/STAT3通路及其下游的凋亡、侵袭和转移蛋白的变化明显强于未敲低STAT3仅加入IlamycinC处理的三阴乳腺癌细胞。
【结论】
本研究发现与临床药物阿霉素和顺铂相比，IlamycinC对三阴乳腺癌细胞具有良好的选择性细胞毒活性。进一步的研究证实，IlamycinC可以通过抑制IL-6诱导的STAT3的磷酸化而减少三阴乳腺癌细胞核内磷酸化STAT3二聚体的水平，从而可以调控下游的caspase凋亡通路而诱导三阴性乳腺癌细胞的凋亡；同时通过调控转移和侵袭通路而抑制三阴性乳腺癌细胞的转移和侵袭。研究结果表明IlamycinC可以作为IL-6/STAT3通路的新型抑制剂而具有治疗三阴乳腺癌的潜在应用价值。