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[目的]
巨噬细胞是抵御微生物入侵的主要免疫细胞，在抗结核免疫中起重要作用，但也有证据表明结核杆菌感染时可逃逸巨噬细胞的杀伤。课题组前期发现环状RNAhsa_circ_0005836在肺结核患者外周血单个核细胞中表达下调，并通过调节巨噬细胞自噬促进其杀菌活性。为了进一步研究hsa_circ_0005836促进巨噬细胞杀菌作用的机制，本研究探讨hsa_circ_0005836对巨噬细胞极化的影响，以及hsa_circ_0005836作为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA， ceRNA)通过circRNA-miRNA-mRNA轴调节巨噬细胞极化的机制。
[方法]
1.应用real-timeqPCR检测hsa_circ_0005836、miRNAs等分子在结核病患者和结核杆菌感染THP-1源性巨噬细胞中的表达水平。
2.应用real-timeqPCR检测hsa_circ_0005836过表达作用下对巨噬细胞中IL-6、IL-1β、HLA-DR、TNF-α、IL-10、CCL22、CD163表达水平的影响。
3.应用流式细胞术和ELISA方法检测hsa_circ_0005836过表达作用下对巨噬细胞中IL-6、IL-1β表达水平的影响。
4.应用生物信息学分析和双荧光素酶报告试验预测并验证hsa_circ_0005836和miRNAs的相互作用。
5.应用real-timeqPCR检测miRNAs模拟物作用下巨噬细胞中IL-6、IL-1β、ETV5、STAT3、STAT4表达的变化。
6.应用real-timeqPCR检测hsa_circ_0005836过表达和miRNAs模拟物共同作用下巨噬细胞中ETV5、STAT3、STAT4表达的变化。
[结果]
1.进一步验证了hsa_circ_0005836在结核病患者的人外周血单个核细胞中显著下调，且其在结核病患者的单核细胞以及BCG感染THP-1源性巨噬细胞中存在下降的趋势。
2.BCG感染THP-1源性巨噬细胞时，M1型巨噬细胞标志物(IL-1β、TNF-α以及膜表面分子HLA-DR)随着感染时间的延长而整体呈下降的趋势。与此相反，M2型巨噬细胞标志物(CCL17、CCL22以及膜表面分子CD163)随着感染时间的延长整体呈上升的趋势。
3.当hsa_circ_0005836过表达后，随着作用时间的延长，结果显示M1型巨噬细胞相关标志物，如促炎因子IL-1β、IL-6和表面分子HLA-DR表达逐渐升高，而M2型巨噬细胞相关标志物，如抑炎因子IL-10、CCL22和表面分子CD163则呈下降趋势。
4.ELISA、RT-qPCR及流式细胞术检测结果显示，在THP-1源性巨噬细胞及CD14+单核细胞中，hsa_circ_0005836过表达作用下，IL-1β、IL-6表达量显著升高。
5.hsa-miR-892c-3p和hsa-miR-219a-5p在结核病患者的PBMCs中表达量显著上升，且在BCG感染后的M2型巨噬细胞中比在M1型巨噬细胞中表达升高。
6.双荧光素酶报告基因试验结果证明，hsa-miR-892c-3p和hsa-miR-219a-5p均能够和hsa_circ_0005836相互作用。但RT-qPCR检测结果显示hsa-miR-892c-3p和hsa-miR-219a-5p模拟物对巨噬细胞中IL-1β、IL-6以及ETV5、STAT3、STAT4表达均未发现有明显的影响。
[结论]
1.结核杆菌感染时，巨噬细胞倾向于M2型极化。过表达hsa_circ_0005836可促进巨噬细胞倾向于M1型极化，表现为IL-1β、IL-6表达量显著增多。
2.hsa-miR-892c-3p与hsa-miR-219a-5p是环状RNAhsa_circ_0005836的下游靶分子，但其是否参与调节结核杆菌感染巨噬细胞的极化尚有待进一步验证。
巨噬细胞是抵御微生物入侵的主要免疫细胞，在抗结核免疫中起重要作用，但也有证据表明结核杆菌感染时可逃逸巨噬细胞的杀伤。课题组前期发现环状RNAhsa_circ_0005836在肺结核患者外周血单个核细胞中表达下调，并通过调节巨噬细胞自噬促进其杀菌活性。为了进一步研究hsa_circ_0005836促进巨噬细胞杀菌作用的机制，本研究探讨hsa_circ_0005836对巨噬细胞极化的影响，以及hsa_circ_0005836作为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA， ceRNA)通过circRNA-miRNA-mRNA轴调节巨噬细胞极化的机制。
[方法]
1.应用real-timeqPCR检测hsa_circ_0005836、miRNAs等分子在结核病患者和结核杆菌感染THP-1源性巨噬细胞中的表达水平。
2.应用real-timeqPCR检测hsa_circ_0005836过表达作用下对巨噬细胞中IL-6、IL-1β、HLA-DR、TNF-α、IL-10、CCL22、CD163表达水平的影响。
3.应用流式细胞术和ELISA方法检测hsa_circ_0005836过表达作用下对巨噬细胞中IL-6、IL-1β表达水平的影响。
4.应用生物信息学分析和双荧光素酶报告试验预测并验证hsa_circ_0005836和miRNAs的相互作用。
5.应用real-timeqPCR检测miRNAs模拟物作用下巨噬细胞中IL-6、IL-1β、ETV5、STAT3、STAT4表达的变化。
6.应用real-timeqPCR检测hsa_circ_0005836过表达和miRNAs模拟物共同作用下巨噬细胞中ETV5、STAT3、STAT4表达的变化。
[结果]
1.进一步验证了hsa_circ_0005836在结核病患者的人外周血单个核细胞中显著下调，且其在结核病患者的单核细胞以及BCG感染THP-1源性巨噬细胞中存在下降的趋势。
2.BCG感染THP-1源性巨噬细胞时，M1型巨噬细胞标志物(IL-1β、TNF-α以及膜表面分子HLA-DR)随着感染时间的延长而整体呈下降的趋势。与此相反，M2型巨噬细胞标志物(CCL17、CCL22以及膜表面分子CD163)随着感染时间的延长整体呈上升的趋势。
3.当hsa_circ_0005836过表达后，随着作用时间的延长，结果显示M1型巨噬细胞相关标志物，如促炎因子IL-1β、IL-6和表面分子HLA-DR表达逐渐升高，而M2型巨噬细胞相关标志物，如抑炎因子IL-10、CCL22和表面分子CD163则呈下降趋势。
4.ELISA、RT-qPCR及流式细胞术检测结果显示，在THP-1源性巨噬细胞及CD14+单核细胞中，hsa_circ_0005836过表达作用下，IL-1β、IL-6表达量显著升高。
5.hsa-miR-892c-3p和hsa-miR-219a-5p在结核病患者的PBMCs中表达量显著上升，且在BCG感染后的M2型巨噬细胞中比在M1型巨噬细胞中表达升高。
6.双荧光素酶报告基因试验结果证明，hsa-miR-892c-3p和hsa-miR-219a-5p均能够和hsa_circ_0005836相互作用。但RT-qPCR检测结果显示hsa-miR-892c-3p和hsa-miR-219a-5p模拟物对巨噬细胞中IL-1β、IL-6以及ETV5、STAT3、STAT4表达均未发现有明显的影响。
[结论]
1.结核杆菌感染时，巨噬细胞倾向于M2型极化。过表达hsa_circ_0005836可促进巨噬细胞倾向于M1型极化，表现为IL-1β、IL-6表达量显著增多。
2.hsa-miR-892c-3p与hsa-miR-219a-5p是环状RNAhsa_circ_0005836的下游靶分子，但其是否参与调节结核杆菌感染巨噬细胞的极化尚有待进一步验证。