【摘 要】
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目的:了解应激对A.suis的生长以及重要毒力基因表达的影响;通过观察15种常见的中药单体对A.suis部分毒力基因的抑制情况,筛选出最佳的毒力抑制剂。方法:在多种固体和液体培养
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目的:了解应激对A.suis的生长以及重要毒力基因表达的影响;通过观察15种常见的中药单体对A.suis部分毒力基因的抑制情况,筛选出最佳的毒力抑制剂。方法:在多种固体和液体培养基上观察A.suis的生长情况,筛选出最佳的固体及液体培养基;模拟四种应激:高温(40℃、41℃、42℃);氧化(200μmmol/L、300μmmol/L、500μmmol/L、1mmol/L H2O2);酸性(pH 5.8、6.2、6.6、7.0 加入乙酸钠);低铁(200μmmol/L、300μmmol/L、500μmmol/L、1mmol/L DTPA)对A.suis ATCC15557进行10min、20min、30min、40min、60min刺激,分别观察四种应激模型对A.suis的生长状况的影响;用Real-time PCR方法观察42℃高温、pH=5.8 的酸、1mmol/L 的 H2O2、1mmol/L 铁螯合剂(DTPA)处理20min、40min、60min检测A.suis重要毒力基因的表达情况;应用Real-time PCR方法检测姜黄素、黄芩苷、盐酸小檗碱等15种中药单体的亚抑菌浓度下ompA、ApxⅢ、tbpA、ashC、hgbA等毒力基因表达水平的抑制作用。结果:1、A.suis生长的最佳液体培养基为BHI肉汤,最佳固体培养基为30%的绵羊血琼脂平板。2、体外模拟高温、低铁、酸性、氧化应激A.suis的生长较正常培养缓慢且菌液浓度偏低。表明A.suis的生长均受到了不同程度的抑制。3、在四种模拟应激条件处理20min、40min、60min后,高温应激模型大多数基因表达下调;低铁应激模型中与铁相关的基因exbD、hgbA、hugZ、tbpA、tbpB的转录水平上调;氧化应激中外毒素(ApxⅢ),溶血素(ashA)、亚铁血红素蛋白(hugZ)以及与铁相关的基因表达量均表现出一定程度上调;酸性应激模型后绝大多数基因表达上调,释放更多的外毒素。4、姜黄素、盐酸小檗碱、黄芩素等15种中药单体对A.suis生长均具有抑制作用,MIC范围为16-64μg/mL。5、五个毒力基因抑制剂的筛选中发现8μg/mL的槐果碱对ApxⅢ毒力基因表达下调250倍;4μg/mL的虎杖苷对ashC基因表达下调了 18倍;16μg/mL的黄芪甲苷对ompA基因表达下调了 3.6倍;16μg/mL虎杖苷对hgbA基因表达下调了 25倍。结论:1、四种模拟应激处理后,高温使大部分毒力基因表达下调,低铁、氧化、酸性应激后绝大多数基因表达上调。2、从15种中药单体中发现槐果碱对ApxⅢ基因,虎杖苷对ashC基因和hgbA基因,黄芪甲苷对ompA基因的表达均具有一定的下调作用。可以作为猪放线菌毒力基因抑制剂的候选药物。
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