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苯是人类日常生活中广泛接触的一种环境污染物。国际癌症研究机构(IRAC)于1982年确认苯是对人类有致癌作用的化学致癌剂,苯的毒性作用机制主要与其氧化代谢产物导致的氧化损伤、基因突变和染色体畸变等相关。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症,是由于G6PD基因突变,导致自身酶活性降低的一种红细胞溶血性疾病。G6PD作为磷酸戊糖路径的初始酶,通过催化合成还原型辅酶Ⅱ及维持谷胱甘肽的还原性,保护细胞免受活性氧簇(ROS)的损害。课题组前期研究发现,G6PD缺陷可加重苯暴露所致K562细胞的氧化损伤和细胞增殖毒性效应,本研究将进一步在动物和人群的水平探讨G6PD缺陷对苯致DNA损伤及DNA甲基化的影响。应用G6PD缺陷小鼠,检测苯暴露后小鼠氧化应激、DNA损伤水平、DNA甲基化和甲基化转移酶生成量的改变,研究G6PD对苯诱导小鼠DNA损伤的调控作用及甲基化改变的影响。进而通过苯暴露职业人群流行病学研究,验证G6PD缺陷对苯致DNA损伤及甲基化改变的影响。1.G6PD缺陷对苯致小鼠骨髓细胞DNA损伤的研究首先构建G6PD缺陷小鼠,采用测序法鉴定小鼠基因型。G6PD低表达C3H/He小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠经150 mg/(kg.d)浓度的苯皮下注射染毒。染毒结束后分析小鼠脏器系数、NADPH/NADP、GSH/GSSG及MDA的含量,检测DNA损伤、端粒长度、端粒酶活性及DNA修复酶基因OGG1、XRCC1基因表达量,研究G6PD调控苯致小鼠骨髓细胞DNA损伤的影响。测序结果显示,G6PD缺陷小鼠含有CTCAGG缺陷序列,C3H正常小鼠含有CTCTGG正常序列,G6PD缺陷动物模型构建成功。染毒以后,G6PD缺陷小鼠肾体比低于正常小鼠(P<0.05),脾体比、胸腺体比高于正常小鼠(P<0.05)。经苯染毒后,G6PD缺陷小鼠的GSH含量和GSH/GSSG比值均低于正常小鼠(P<0.05),其MDA含量高于正常小鼠(P<0.05)。彗星实验结果显示暴露于苯的G6PD缺陷小鼠尾DNA%及Oliver尾矩均明显高于正常小鼠(P<0.05)。端粒检测结果发现,G6PD缺陷小鼠的端粒长度及端粒酶活性均低于正常小鼠(P<0.05)。RT-PCR结果显示,染毒后,G6PD缺陷小鼠的OGG1、XRCC1 mRNA相对表达量均低于正常小鼠(P<0.05)。以上结果表明,苯暴露时G6PD缺陷小鼠可能不足以维持辅酶Ⅱ的还原形式,生成足够的GSH,因此G6PD缺陷小鼠的氧化损伤加重,MDA含量上升。过量的氧化产物累积,损伤DNA,缩短端粒,抑制DNA修复基因和端粒酶的生成,进一步加深G6PD缺陷小鼠的DNA损伤。2.G6PD缺陷对苯致小鼠骨髓细胞DNA甲基化的研究首先构建G6PD缺陷动物模型,采用测序法鉴定小鼠基因型。G6PD低表达C3H/He小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠经150 mg/(kg.d)浓度的苯皮下注射染毒。染毒结束后通过比色法检测小鼠DNA甲基化水平,采用RT-PCR检测DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA相对表达量,研究G6PD调控苯致小鼠甲基化改变的影响。实验结果表明,苯暴露后G6PD缺陷小鼠的DNA甲基化相对水平低于正常小鼠(P<0.05)。染毒后G6PD缺陷小鼠的DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的相对表达水平均低于正常小鼠(P<0.05)。综上可得,苯暴露后,G6PD缺陷引起更高的氧化应激水平,抑制DNMTs的生成,无法维持原有的甲基化水平。3.G6PD表达水平对苯暴露人群DNA损伤及DNA甲基化的影响本研究应用职业流行病学调查方法,选取扬州市苯暴露工人为研究对象,进行健康体检和问卷调查,应用RT-PCR法检测研究对象端粒长度、G6PD、hOGG1及XRCC1基因相对表达量,通过比色法检测G6PD酶活性,探讨G6PD表达水平对苯暴露人群DNA修复酶表达及端粒长度的影响。结果显示,hOGG1和XRCC1基因相对表达量在G6PD基因相对表达水平的分布上有差异,线性回归分析得,G6PD mRNA表达水平是DNA修复酶hOGG1及XRCC1表达的影响因素之一。研究结果提示苯暴露后,G6PD缺陷导致可能导致抗氧化能力降低,DNA修复酶hOGG1及XRCC1生成不足,DNA损伤加重。进而探讨G6PD表达水平对苯暴露人群DNA甲基化的影响。应用比色法检测苯暴露人群的DNA甲基化水平,通过RT-PCR法检测DNMTs表达量。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因表达相对水平在G6PD表达水平分布上有差异(P<0.05)。DNA甲基化水平在G6PD表达水平的分布上未显现差异(P>0.05)。结果提示作业工人接触苯以后,体内发生氧化应激,G6PD缺陷的人群不能代谢过量的ROS,最终抑制DNMTs的生成。G6PD表达水平对苯致DNA甲基化的调控存在一定影响,但仍需扩大样本量,深入该研究。