在二倍体栽培甜菜(Beta vulgaris L.)的染色体组上加入了野生白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)第9号染色体而得到的单体附加系——甜菜M14品系,具有很多特殊的性状,如耐盐、抗旱、耐寒和无融合生殖等,甜菜M14品系是去发掘优质基因与蛋白质点的极其难得的植物材料。前期工作中,课题组在比较未处理组的对照,对200、400 mM NaCl处理下,甜菜M14品系的叶片及根部总蛋白开展了定量蛋白质组学研究,在叶中获得40个差异蛋白质,根中获得36个差异蛋白质,本研究的甜菜M14品系丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase,STPK)是一个响应根部盐胁迫与信号转导相关的差异蛋白质点,受盐胁迫上调表达3.24倍。STPK用来使多种功能蛋白发生磷酸化,是一类特别的蛋白激酶,参与多种生命过程中。从相关研究中发现,STPK对盐、干旱和低温胁迫诱导有显著的抗性作用,可以参与各种代谢过程。本试验基于课题组前期盐胁迫蛋白质组学研究,并在相同盐浓度处理下的转录组数据库中获得基因的cDNA序列,利用PCR操作得到甜菜M14品系丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(BvM14-STPK)cDNA全长,共计1 668bp,最大ORF为1 527bp,编码508个Aa,具有STPK保守结构域,该基因编码的蛋白成亲水性,属蛋白激酶C家族。荧光定量数据揭示在甜菜M14品系叶、根中BvM14-STPK基因均有广泛表达,与未胁迫组比,在200、400mM NaCl浓度下生长的叶片中,该基因均上调表达;而在200、400mM NaCl处理的根部中,该基因先上调表达,后下调表达,说明该基因可以迅速应答盐胁迫,但在不同组织中的表达情况并不相同。磷酸化是细胞参与生命活动过程中的必不可少反应,识别具有行使功能的磷酸化位点是确定蛋白磷酸化机制的必要步骤,本试验进一步构建了BvM14-STPK基因的原核表达体系来研究其磷酸化位点,以未转基因的空载菌株为对照,对转BvM14-STPK基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌体进行诱导蛋白表达,在37℃、0.5 mM IPTG的诱导下蛋白表达量最大,结果表明BvM14-STPK蛋白主要表达位置为沉淀中,存在的主要形式是包涵体;Western印迹结果呈阳性,说明BvM14-STPK融合蛋白能正确表达,进一步对蛋白质样品进行胶内酶解,并经过除盐、富集,酶解后的多肽段采用LC-MS/MS举行质谱鉴定,并进行Green Plant Database检索,通过质谱匹配肽段数量、蛋白质序列覆盖度和MS/MS图谱质量来判断,共鉴定了8个关键的Ser磷酸化位点。磷酸化过程中位点对蛋白激酶的作用需要进一步进行鉴定,相邻Ser磷酸化位点的功能互补关系,将采取对鉴定的Ser磷酸化位点进行分段突变,共分为5段,分别将Ser突变成Asp和Phe,使蛋白激酶持续磷酸化和非持续磷酸化,并通过叶盘法侵染转入烟草中。