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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)是亚油酸(Linoleic Acid, LA)衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有多种营养和保健功能,如抗癌、抗动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种异构体中c9, t11-CLA被认为最具有生物活性。利用乳酸菌进行生物转化共轭亚油酸由于反应条件温和,产物异构体较单一,以及易于操作和控制,成为了当前生物转化共轭亚油酸领域的一个研究热点。而亚油酸异构酶作为乳酸菌生物转化共轭亚油酸的一个关键酶,近来也成为了研究的一个焦点。植物乳杆菌ZS2058是本实验室从泡菜中筛选到的一株具有亚油酸异构酶活性的乳酸菌。采用超声波破碎和溶菌酶消化相结合的方法来对植物乳杆菌ZS2058中的亚油酸异构酶进行提取,超声波法提取该亚油酸异构酶的最佳条件是:破碎功率400W,破碎时间7.5min (破碎5s,间歇9s)。通过对细胞破碎液进行差速离心分级沉淀,将收集到的不同组分进行酶活检测,发现膜沉淀组分中的亚油酸异构酶活性占所有组分总酶活的70%。因此,该亚油酸异构酶为膜结合蛋白。又通过研究Triton X-100和NaCl对该亚油酸异构酶粗酶液活性的影响,进一步证实了该亚油酸异构酶为膜结合蛋白,而且是一种膜内在蛋白。对亚油酸异构酶粗酶性质的研究发现,底物LA浓度对亚油酸异构酶活性的影响非常显著,当亚油酸的浓度高于0.08mg/mL时,亚油酸异构酶的活性会受到很明显的抑制;而加入5%的甘油则能增强粗酶液中亚油酸异构酶的稳定性。本文对该亚油酸异构酶的分离纯化进行了研究。硫酸铵分级沉淀的硫酸铵饱和度适宜取值范围为20%-50%;阴离子交换层析采用梯度洗脱的方法,当缓冲体系Tris-HCl缓冲液(20mM,1%Triton X-100,5%甘油)的pH值为9.0时,亚油酸异构酶在NaCl浓度为0.12M处被洗脱下来,并获得了较好的纯化效果。亚油酸异构酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析后,得到了电泳纯的亚油酸异构酶,纯化倍数为8.49倍,比酶活为168.58U/mg。经SDS-PAGE分析,该亚油酸异构酶的分子量约为66kDa。本文又对纯化后的亚油酸异构酶的酶学性质进行了研究。研究结果表明,该亚油酸异构酶的最适温度为35℃,最适pH为5.5;该亚油酸异构酶的耐热性较差;多种金属离子对亚油酸异构酶活性的影响均不显著;金属螯合剂EDTA和EGTA对亚油酸异构酶活性的影响不显著;多种辅酶因子对亚油酸异构酶活性的影响也不显著;通过采用Lineweaver-Burk双倒数法求得该亚油酸异构酶的动力学参数Km=2.15×10-5mol/L,Vmax=3.71×10-9mol/ (min?mg)。