柑橘溃疡病菌和西甜瓜果斑病菌致病相关基因的功能研究

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柑橘溃疡病和西甜瓜果斑病均是生产上重要的细菌病害,分别由Xanthomonas citri subsp.Citri(Xcc)和Acidovorax citrulli(Ac)引起。本研究以两种病原细菌为研究对象,对其致病相关基因进行了分离,并对其致病功能进行了分析,结果如下:1.柑橘溃疡病菌TALE蛋白在柑橘中的靶标基因的鉴定Xcc TALE(transcription activator-like effector)蛋白可通过细菌的Ⅲ型分泌系统(type III secretion system)分泌进入柑橘细胞核中,结合其靶标基因的启动子区(TAL effector-binding element,EBE),调控靶标基因的转录表达。Xcc中存在至少5个新的tal基因。为了鉴定其在柑橘中的靶标基因,我们分离克隆了这5个新的tal基因,将其逐一转移至一个无tal的菌株Xcc049E菌株中,分别注射接种柑橘甜橙叶上。致病性测定发现,这5个tal基因并不像pthA那样具有明显的毒性功能,但对细菌生长具有促进作用。24 h后采集柑橘叶接种区域组织进行RNA深度测序,发现了一批5个tal基因存在而上调表达的柑橘基因。按照TALE蛋白的RVD序列进行其结合DNA序列预测,对上调表达的柑橘基因进行了排查,获得了各TALE蛋白结合的候选靶标基因。通过凝胶滞阻实验(electrophoresis mobility-shift assay,EMSA),发现效应蛋白086-78可与Cs2g22130基因的启动子结合,003-4.4可与Cs3g16800及Cs5g34120基因启动子结合,说明Cs2g22130可能是效应蛋白086-78的靶基因,而Cs3g16800及Cs5g34120可能是效应蛋白003-4.4的靶基因。这一发现,对于进一步研究柑橘溃疡病菌与柑橘的互作机制奠定了工作基础。2.柑橘溃疡病菌甘油-3-磷酸脱氢酶在致病性中的作用柑橘溃疡病菌体内存在PthA效应蛋白,推测病原菌中可能存在PthA的靶标基因。根据PthA的RVD序列预测,发现编码甘油-3-磷酸脱氢酶基因(glycerol-3-phosphate dehydrogenase,gpd1)的启动子中存在其可能结合的EBE序列。为了鉴别其是PthA的靶标基因,分别对Xcc弱毒菌株Xcc049E和强毒菌株Xcc021进行了gpd1基因的敲除。致病性测定发现,gpd1基因缺失后影响强毒菌株Xcc021在柑橘上的毒性和细菌生长能力;生物学性状测定发现,与野生型菌株相比,Xcc021菌株的gpd1突变体的群体聚集能力和游动性降低,生物膜形成能力提高。这表明,gpd1基因在柑橘溃疡病菌中是重要的毒性因子。3.西甜瓜果斑病菌avrRxo1基因激发玉米Rxo1抗性产生的研究生物信息学分析发现,西甜瓜果斑病菌基因组中存在与水稻条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola,Xoc)avrRxo1基因的同源基因avrRxo1Ac。已有结果显示,avrRxo1与玉米中的R基因Rxo1对应,可启动植物产生抗病性。为了揭示avrRxo1Ac能否激发玉米R基因Rxo1介导的抗病性,我们克隆了西甜瓜果斑病菌的avrRxo1Ac基因,并将其置于Xoc的avrRxo1突变体中,发现其不能互补avrRxo1突变体,在含有Rxo1玉米上不再能激发过敏反应(HR);在玉米上通过农杆菌瞬时表达AvrRxo1Ac基因,也不能像avrRxo1一样激发玉米产生HR。这些结果表明,西甜瓜果斑病菌avrRxo1Ac的基因不能与Rxo1基因变现为“基因对基因”关系,暗示Rxo1抗病基因转入西甜瓜中也不会起到抗西甜瓜果斑病的作用。
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