近年来,随着沿海地区人口日益密集,人类活动日益频繁,尤其是生活污水和工业废水的大量排放,水体富营养化日趋严重,有害藻类水华（harmful algal blooms,HABs）产生和规模都有所增长。所以,人们亟需建立迅速高效检出有害藻类的新方法。随着分子生物学技术的进一步发展,将三明治杂交、荧光原位杂交组织化学技术、荧光定量PCR、等温扩增等新技术应用于有害藻类的检测。虽然这些方法可以准确、特异性地检测现场样品中的目标物种,但都表现出单一目标特异性的共同缺点,不能同时检测多种有害藻类物种。因此,迫切需要开发能够满足同时分析多个有害藻种的多重检测方法,旨在及时有效地监测水体中所有可能形成HABs的藻种。因此,本研究建立了一种针对有害藻的新型多重检测技术-多重酶保护分析结合反向斑点杂交（multiplex enzyme protection analysis-reverse dot blot hybridization,m NPA-RDBH）。本研究以沿海常见有害藻塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）、海洋卡顿藻（Chattonella marina）、赤潮异湾藻（Heterosigma akashiwo）、微小原甲藻（Prorocentrum minimum）和强壮前沟藻（Amphidinium carterae）为研究对象,建立了一种能够同时检测五种有害藻的m NPA-RDBH。首先通过克隆测序获得目标藻的序列信息。提取目标藻的RNA后逆转录,以逆转录的c DNA为模板对核糖体大亚基（ribosomal large subunit DNA,LSU rDNA）D1-D2区进行RCR扩增,将扩增产物切胶回收,将目的片段与载体连接,导入感受态细胞,筛选阳性克隆菌株送去生物公司测序。将测序结果在NCBI上进行比对分析,确定其正确性。从Genebank中下载亲缘关系较近的同属藻种序列。在Bio Edit上将下载的序列与目标藻种的序列进行比对分析,目测找到目标藻种的特异性区间设计NPA探针（NPAP）、信号探针（SP）和捕获探针（CP）。成功建立mNPA-RDBH体系后,首先验证探针之间的交叉反应,先验证CP与SP无杂交,然后验证NPAP的交叉反应,最后选取19种常见微藻验证NPAP的特异性。对所建立的体系进行优化,最终优化体系条件为RDBH杂交时间2 h、RDBH杂交温度48℃、RDBH洗膜温度48℃、NPAP浓度20 n M、RNA与NPAP杂交温度48℃、RNA与NPAP杂交时间1 h。为了验证本研究的实用性,评估了该体系的灵敏度、稳定性和模拟自然水样。细胞灵敏度和模拟自然水样测试结果表明,m NPA-RDBH对塔玛亚历山大藻、海洋卡顿藻、微小原甲藻的检测限为102 cells m L-1,对赤潮异湾藻和强壮前沟藻的检测限为103 cells m L-1,m NPA-RDBH体系稳定性测试结果表明,添加干扰藻种后结果并没有受到影响,仍然可以正常杂交,且添加不同数量的干扰藻种也对实验结果并没有影响,因此本研究所建立的mNPA-RDBH体系稳定。本研究建立了针对五种有害藻同时进行检测的m NPA-RDBH检测体系,能够精准识别,特异性强,因此有望可以成为在自然环境中检测有害藻的有力工具。