炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)致死率极高,是人畜共患烈性传染病-炭疽病(Anthrax)的病原体。并且炭疽芽胞杆菌来源广泛、易于培养,被作为一种A类生物战剂进行管理,其防生和反恐一直以来都具有重要的军事意义和社会意义。炭疽的防控手段包括预防和治疗,二者分别主要依赖于炭疽疫苗和抗菌素,但是这两种药物均需在感染前或感染初期立即使用。而炭疽毒素中和抗体在宿主感染后,能快速有效中和体内产生的炭疽毒素,同时发挥补体依赖细胞毒性作用和抗体依赖细胞毒性作用,是目前最有前景的炭疽治疗药物。自从1975年杂交瘤技术出现后,多年来单抗治疗主要依赖于鼠源单抗。但是鼠源单抗半衰期短、毒副作用明显,大大制约了其临床应用。全人源单克隆抗体应用于人体时具有无免疫原性、半衰期长,国外大多数新开发项目现已转向全人源单抗的研发。目前全人源单抗制备的方法主要是通过人人杂交瘤技术、转基因鼠技术、抗体库技术和单细胞PCR技术,其中通过单细胞PCR技术可直接从人单个B细胞中扩增抗体基因,无需细胞融合培养和抗体多轮筛选的过程,能够在最短7天内筛选获得有效的全人源单抗,而其他几种抗体制备方法均需要数周甚至数月,建立这种快速高通量抗体筛选平台,将有助于提升我国新发突发传染病的应对能力;并且,单细胞PCR技术完整保留了抗体重链轻链在人体内的天然配对方式,因此可在获得治疗抗体的同时更加直观、深入地研究人体免疫机制。但是,由于单个细胞内基因拷贝数非常低,单细胞PCR技术的实现难度大,目前国内罕见成功通过该技术获得单抗的研究团队。目前大部分炭疽单抗仍然是鼠源单抗,少数研究者从大猩猩、转基因鼠和人体中筛选获得了炭疽单抗,而我国仍未见全人源的抗炭疽毒素单抗报道。鉴于炭疽毒素作用机制的复杂性,研发更多的针对不同中和表位的炭疽全人源单抗,能够有效避免炭疽毒素被人为突变带来的生物恐怖威胁,为炭疽的治疗提供更多选择。鉴于此,本文目的在于建立流式分选-单细胞PCR快速高通量的抗体筛选技术平台,并通过该技术平台从重组炭疽保护性抗原(protective antigen,PA)疫苗免疫的志愿者体内,筛选获得全人源PA中和抗体,并对单抗的亲和力、抗原结合表位、毒素中和机制、单抗联合用药效果等进行深入研究。首先对一名男性志愿者在第0天和28天两次免疫了重组PA疫苗,并在第0、28、35天采集志愿者血液样品。为确保能够在合适的时间点采集志愿者阳性的血液样品,从而提高后续PA抗体筛选的阳性率,本文通过ELISA和TNA的方法,对不同时间点血清中PA结合和中和抗体滴度进行测量。结果表明,免疫第35天血清中PA结合抗体和中和抗体滴度均明显升高。同时,通过ELISpot的方法,对不同时间点血液中抗体分泌细胞的数量变化进行检测。结果显示抗PA抗体阳性的抗体分泌细胞占总Ig G阳性的抗体分泌细胞的比例,从免疫后第28天的0.8%上升至免疫后第35天的23.8%,可见抗PA抗体阳性的抗体分泌细胞个数大幅升高。表明重组PA疫苗在志愿者体内有效激发了体液免疫反应,在免疫后第35天时体液免疫水平显著升高,为后续抗体的分选提供保证。为了实现单个B细胞的分选和抗体基因的单细胞PCR扩增,我们尝试了多种细胞分选和单细胞PCR的方法,在经历多次失败后,最终采用流式细胞分选抗体分泌细胞,以及多重引物组合的单细胞反转录-巢式两步PCR的方法,成功从人单个B细胞中扩增获得抗体基因。在单细胞PCR条件优化的过程中,我们发现引物设计、酶的种类和模板量对于扩增效率的影响较大,而退火温度对于扩增效果影响甚微。在成功实现研究中抗体分选的关键性技术-流式分选单个抗体分泌细胞和单细胞PCR技术后,采集了志愿者免疫后第35天的血液样品,通过密度梯度沉降法从血液样品中分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在对一组抗体分泌细胞表面特异的白细胞分化抗原簇(cluster of differentiation,CD)分子进行荧光染色后,通过流式细胞分选仪从PBMC中分选获得2112个单个抗体分泌细胞克隆,通过单细胞PCR扩增单个细胞中的抗体基因。结果显示,529个单细胞克隆重链和轻链同时扩增成功的比率,即单细胞PCR的阳性率约为25%。在硬件条件满足的情况下,仅需1~2天即可完成以上单细胞的分选和抗体基因扩增的过程。如果采用传统的克隆方法,构建529对抗体基因的表达质粒,非常耗时费力。为了快速、高通量表达抗体基因,我们设计了可直接通过PCR融合启动子、前导序列、抗体全长基因、多聚A尾(poly(A)tail)的线性表达框。我们对线性表达框PCR条件进行优化,并使用一株对照抗体验证线性表达框所表达抗体的表达量和功能。结果显示,经线性表达框方法表达的抗体浓度可达0.4μg/m L,且良好保持了抗体中和效果,能够满足后续抗体筛选实验的要求,通过我们设计的线性表达框可在最短3天内表达供后续筛选用的抗体。在确保方法的可行性后,我们按照优化的重叠延伸PCR条件,构建了529对抗体重链和轻链线性表达框,并将配对的基因共转染至HEK 293T细胞中进行表达。继而,通过ELISA和TNA的方法对529株全人源单抗进行PA结合和中和活性的检测,并鉴定了单抗的特异结合的PA结构域。结果显示,我们成功通过建立的抗体筛选平台技术获得34株PA结合单抗,其中4株单抗(2A6、4A3、8H6、22F1)具有PA中和活性。中和单抗22F1与PA不结合,而是通过与PA的变构体PA63结合发挥作用。另外,研究发现PA结合单抗中有一种能够加速细胞死亡的毒素增强抗体(Toxin enhancing m Ab),占PA结合单抗的比例达55.9%之多。为了进一步探究PA中和抗体和毒素增强抗体的特性,构建4株PA中和抗体和1株毒素增强抗体8A7的表达质粒,转染并纯化抗体蛋白;并从以下几个方面对抗体的功能进行研究:1)通过BLI技术测定了5株重点研究的单抗的亲和力,结果显示除22F1外单抗亲和力均在纳摩尔级;2)测定4株中和单抗在体内和体外的中和活性,结果显示4株中和单抗中22F1单抗中和活性最强,其体外保护效果较上市PA单抗报道结果高出近一个数量级,而单抗2A6仅在体外具有保护活性;3)鉴定中和单抗的中和机制,结果表明8H6单抗对PA呈现抗体浓度依赖的酶切抑制作用,4A3单抗通过促进PA63的降解而抑制PA七聚体形成,4A3这种类似酶活作用的毒素中和机制尚未见报道,提示本研究可能发现了一株新中和机制的PA中和单抗。毒素增强单抗8A7能促进PA七聚体的形成,并与PA七聚体结合,提示其毒素增强作用的可能机制;4)分析单抗的联合用药效果,结果表明2A6和4A3、8H6和22F1表现出较弱的协同作用;2A6和8H6、2A6和22F1表现出无关作用;4A3和8H6、4A3和22F1表现出拮抗作用。而单抗联合用药协同效果最为显著的,是毒素增强单抗8A7与仅在体外具有中和活性的单抗2A6,二者联合用药能够在体内发挥高水平的毒素中和效果。结果提示我们,在人体内之所以大量产生毒素增强抗体的可能原因是,这种抗体在血液中能够辅助其他抗体发挥良好的机体保护效果。并且,8A7单抗针对的PA结构域3是目前普遍认为的PA非中和位点,根据本文所得结果推测针对PA结构域3表位的单抗,在人体内能够通过与其他抗体协同发挥重要的生物学功能,这种辅助性单抗在抗体筛选过程中容易被遗漏,但是其在“鸡尾酒”治疗中发挥的重要作用不容忽视。综上所述,本文建立了基于流式分选和单抗PCR技术的快速抗体筛选平台,能够为新发突发传染病抗体研究提供技术储备;筛选制备了多株不同中和机制的全人源PA中和单抗,其中包含新中和机制的单抗和高中和活性的单抗,是具有前景的炭疽治疗药物;同时,对抗体中和机制、表位、联合用药效果的研究,也为炭疽毒素作用机理研究、疫苗设计和“鸡尾酒”抗体药物设计提供有力依据;