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单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）,是一种食源性致病菌,在自然界中广泛存在,常通过污染的食物感染人和动物。该菌为胞内寄生菌,可穿越宿主血脑屏障,肠道屏障及胎盘屏障,临床上引起腹泻、脑膜脑炎、败血症、新生儿溶血、肝炎及流产等症状,发病率及死亡率较高。LM细胞壁表面存在多种毒力蛋白,其中有一类至关重要的表面蛋白,其C-末端区含有LPXTG（Leu-Pro-X-Thr-Gly）保守基序,由分选酶Sort A识别共价结合到细胞壁肽聚糖上,呈现在细胞表面,发挥其毒力作用。根据LM EGD-e参考菌株的全基因组序列预测有41种LPXTG基序蛋白,其中Lmo0159和Lmo0160功能未知,本研究以李斯特菌病绵羊脑分离株LM90SB2为研究对象,对lmo0159、lmo0160基因进行克隆及生物信息学分析;利用同源重组技术分别构建LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160基因缺失株,分析其在环境耐受性、生物被膜形成能力及细胞水平和动物机体毒力的差异,以探讨lmo0159和lmo0160基因的功能,为进一步研究LM的致病机理奠定了基础。主要研究内容和结果如下:1.LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因克隆及序列分析:为了了解LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因编码蛋白的特征,利用PCR方法扩增lmo0159、lmo0160基因,分别连接pMD19-T载体,测序分析其特征。结果显示:lmo0159序列全长2 070bp,编码617个氨基酸;lmo0160序列全长为1 708bp,编码475个氨基酸;lmo0159、lmo0160基因核苷酸序列分别与不同来源4b型LM同源性均高达99%以上。Lmo0159蛋白是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白;Lmo0160蛋白为疏水性蛋白。两种蛋白均含有胶原蛋白结合域和Cna B功能域。本研究成功克隆LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因,并初步预测分析了目的基因部分生物学特征,为进一步研究LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因功能提供了理论依据。2.LM90SB2-（35）lmo0159、LM90SB2-（35）lmo0160缺失株的构建及鉴定:为研究lmo0159、lmo0160基因的功能,本试验利用PCR技术分别扩增lmo0159、lmo0160基因的上下游同源臂,SOE-PCR方法进行同源臂融合,获得（35）lmo0159、（35）lmo0160缺失片段,分别连接到pMD19-T载体,获得pMD19-T-（35）lmo0159、pMD19-T-（35）lmo0160,测序成功后,经双酶切并连接至pKSV7,获得重组穿梭质粒pKSV7-（35）lmo0159和pKSV7-（35）lmo0160,分别电转化到LM90SB2感受态细胞中,获得阳性转化子,置于含10μg/m L氯霉素BHI培养基中,42℃传代培养,获得LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160基因缺失株。再置37℃无抗性BHI培养基传代培养30代,PCR检测遗传稳定性,结果显示LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160基因缺失株构建成功,且遗传稳定。3.LM90SB2-（35）lmo0159、LM90SB2-（35）lmo0160缺失株环境适应性和生物被膜形成能力的研究:为探讨lmo0159和lmo0160基因缺失对LM环境适应性和生物被膜形成能力的影响。本试验测定了不同温度、pH、NaCl、乙醇胁迫环境下细菌生长情况及生物被膜形成能力。结果显示:在37℃和42℃培养条件下,LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160的生长低于LM90SB2;在0.5%和2.5%NaCl BHI中,LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160的生长低于LM90SB2;在3%和3.5%乙醇BHI中,LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160的生长低于LM90SB2;显微镜观察LM90SB2-（35）lmo0159和LM90SB2-（35）lmo0160形成生物被膜的交联密集度均低于LM90SB2;生物被膜定量分析发现,随着时间的延长,OD57070 nm差异也增大,尤其在48h,差异均为极极显著（P?0.001）。结果表明,lmo0159和lmo0160基因的缺失降低了LM90SB2对环境的适应性和生物被膜形成能力。4.LM90SB2-（35）lmo0159、LM90SB2-（35）lmo0160缺失株毒力的研究:为探讨lmo0159和lmo0160基因缺失对LM毒力的影响。本试验分别用亲本株和缺失株对MBMEC、RAW264.7、SIEC和HBMEC细胞进行粘附、侵袭及细胞内增殖试验,及对小鼠腹腔感染后测定肝、脾、脑载菌量及小鼠存活时间。结果显示:LM90SB2-（35）lmo0159较LM90SB2,对SIEC及RAW264.7细胞的粘附率、侵袭率均降低,差异极显著（P?0.01）;LM90SB2-（35）lmo0160较LM90SB2,对RAW264.7细胞的粘附率、侵袭率均降低,分别为差异极显著（P?0.01）与差异显著（P?0.05）;缺失株对MBMEC、SIEC及HBMEC的胞内增殖量均降低;缺失株小鼠存活时间较亲本株均显著延长（P<0.05）;LM90SB2-?lmo0159和LM90SB2-?lmo0160对小鼠LD50较LM90SB2分别下降了0.97和0.86个数量级;缺失株较亲本株,在肝和脾中的载菌量均降低。试验结果表明lmo0159和lmo0160基因缺失后均降低了LM90SB2的毒力。