研究背景与目的结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球发病率第3和死亡率第4的肿瘤,2018年新增病例近200万,死亡人数近100万。目前主要的治疗方法为腹腔镜手术、化疗、放疗等,但其对治愈率和长期生存率的影响有限,急需开发新的治疗方案。肥胖、缺乏运动、饮酒、吸烟等已被确定为结直肠癌发生的危险因素。此外,基因结构的异常也是结直肠癌发生的一个重要原因。结直肠癌中除了存在APC、K-Ras等原癌基因以及p53等抑癌基因的突变外,一个重要的特征是其存在较大比例的微卫星不稳定性（microsatelliteinstability,MSI）。微卫星不稳定性导致结直肠癌更容易积累突变,更易产生能够被免疫系统识别的新抗原,也使结直肠癌患者对免疫疗法有很好的反应。溶瘤病毒具有能选择性在肿瘤细胞内复制裂解肿瘤细胞、引起机体抗肿瘤免疫等特性而成为近年来很有潜力的肿瘤免疫治疗新方法。溶瘤病毒以多形式多途径与机体免疫系统相互作用,改善肿瘤免疫微环境,增强免疫细胞的浸润,激活肿瘤特异性免疫反应。抗肿瘤免疫的活化是溶瘤病毒发挥疗效的一个重要方面,也是溶瘤病毒疗法相比手术、化疗和放疗的一个显著优势。肿瘤免疫的活化不但对不能手术的肿瘤灶有作用,而且还可以作用于远端转移瘤,有效的防止肿瘤的复发。目前已有3种溶瘤病毒获批用来治疗肿瘤,包括用于治疗含黑色素瘤在内的多种癌症的Rigvir、治疗晚期头颈部肿瘤的Oncorine（H101）以及治疗黑色素瘤的 talimogene laherparepvec（T-Vec）。溶瘤痘苗病毒作为治疗肿瘤的一种很有潜力的制剂,在过去的20多年里得到了系统广泛的研究且取得重要进展。目前已有多种基因工程溶瘤痘苗病毒先后进入临床试验。其中JX-594（pex-vec）,一个非常有潜力的用于治疗晚期肝癌的痘苗病毒进入了临床三期的研究。遗憾的是相比其他的治疗手段,并未显示出更好的疗效,迫切需要开发新一代的溶瘤病毒制剂。痘苗病毒在自然界长期选择压力下获得的毒力基因以及调节机体免疫能力的基因增强了痘苗病毒的生存能力。胸苷激酶（Thymidine kinase,TK）基因与多种肿瘤的发生相关,该基因对于病毒在静止细胞中复制是必不可少的,但在分裂期细胞中的复制不是必需的,TK基因的删除增强了病毒的肿瘤选择性,且可降低痘苗病毒的毒力。N1L基因也是痘苗病毒很重要的毒力基因,具有明显的神经毒作用,研究表明N1L基因的删除能有效降低痘苗病毒的毒力。而在鼻感染痘苗病毒的疾病模型中,缺失N1L并不影响CD4+T和CD8+T细胞向肺炎症部位的浸润,也不影响这些细胞的细胞毒性T细胞活性。我们推测痘苗病毒双删除TK基因和N1L基因既可增强痘苗病毒的肿瘤选择性又可以降低痘苗病毒的毒性。白细胞介素21（interleukin 21,IL-21）能通过多种途径增强机体细胞免疫能力。IL-21体外可增强特异性CD8+T细胞的抗原亲和力,联合IL-15可上调细胞毒性T细胞的共刺激信号CD28的表达,体外协同IL-15可刺激记忆细胞和初始CD8+T细胞的扩增,通过STAT1信号通路介导CD8+T细胞转录因子T-bet的活化,诱导表达颗粒酶和穿孔素,增强细胞毒活性。此外,IL-21可诱导小鼠NK细胞分化为效应细胞,表达高水平的IFN-y和穿孔素等杀细胞效应物质。课题组团队首先利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在VVΔTK的病毒的基础上构建了新型溶瘤病毒VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21。研究其在体外对小鼠结肠癌细胞CMT93、CT26和肺癌细胞CMT64、CMT167、CMT170、LLC的复制和杀伤能力;体内治疗小鼠CMT93、CT26、CMT64细胞皮下瘤的能力以及CT26肝转移瘤的能力;并研究其治疗CMT93皮下瘤及CT26转移瘤的潜在机制。第1部分 新型溶瘤痘苗病毒对CMT93、CT26、CMT64皮下瘤模型的治疗作用目的检测新型溶瘤痘苗病毒在肿瘤细胞内的复制杀伤能力及对肿瘤细胞皮下瘤模型的治疗作用。方法1.细胞杀伤实验（MTS法）检测溶瘤痘苗病毒对小鼠结肠癌细胞系和肺癌细胞系的杀伤能力。2.复制实验检测病毒在小鼠结肠癌细胞系和肺癌细胞系的复制能力。3.建立小鼠肺癌细胞系CMT64、结肠癌细胞系CMT93及CT26皮下瘤模型,检测溶瘤痘苗病毒治疗这3种细胞皮下瘤模型的疗效。结果1.VVΔTKΔ-mIL21 和 VVΔTKΔN1L-RFP 对 CMT93、CMT64、CMT167、CMT170、LLC均有较强的杀伤能力,且这些细胞均支持病毒的复制。溶瘤痘苗病毒VVΔTKΔN1L-mIL21在CMT93中复制,可以产生mIL21并分泌到细胞外。2.VVΔTKΔN1L-mIL21 对 CT26 杀伤能力较低,EC50 均值达 57 PFU/cell。VVΔTKΔ-mIL21在CT26细胞中的复制能力也相对较弱。3.VVΔTKΔN1L-mIL21 及 VVΔTKΔN1L-RFP 的治疗可有效延缓 CMT64、CT26皮下瘤生长。4.VVΔTKΔN1L-mIL21 及VVΔTKΔN1L-RFP 的治疗可部分清除 CMT93 皮下瘤模型,VVΔTKΔN1L-mIL21治疗组7只小鼠经治疗后有6只小鼠CMT93皮下瘤消失,肿瘤清除率达85.7%;VVΔTKΔN1L-RFP治疗组7只小鼠经治疗后有3只小鼠皮下瘤消失,肿瘤清除率为42.9%,两病毒治疗组间存在显著差异。结论VVΔTKΔN1L-mIL21治疗有效延缓CMT64、CT26皮下瘤生长,部分清除了 CMT93皮下瘤,清除率达85.7%（6/7）。第2部分 新型溶瘤痘苗病毒治疗结直肠癌细胞系CMT93皮下瘤机制的研究目的研究新型溶瘤痘苗病毒治疗CMT93皮下瘤潜在作用机制。方法1.建立CMT93皮下瘤模型,待小鼠皮下瘤平均体积长到150 mm3时随机分为3组,使每组小鼠肿瘤平均体积相同,分组当天记为D1天。D1、D3、D5天分别用 PBS 100 μL/鼠、VVΔTKΔN1L-RFP 1×108 PFU/100 μL/鼠、VVΔTKΔN1L-mIL21 1×108 PFU/100 μL/鼠对 3 组小鼠进行治疗。2.D7、D14、D20天,随机取各实验组小鼠3只,收集其淋巴结、脾脏、皮下瘤、血清。3.组化检测皮下瘤冰冻切片CD4+T、CD8+T的浸润,检测痘苗病毒衣壳蛋白、检测mIL21蛋白。4.流式分析淋巴结和脾脏中T细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞以及NK细胞的改变。5.IFN-γ释放实验检测不同实验组小鼠脾细胞对肿瘤细胞及病毒肽的反应。结果1.病毒治疗3次后,D20天,VVΔTKAN1L-mIL21治疗部分清除CMT93皮下瘤（2/3）。2.病毒治疗后,改变了 CMT93皮下瘤微环境,两病毒治疗组与PBS组相比,皮下瘤组织CD4+T和CD8+T细胞的浸润显著增加。3.病毒治疗后D7天,VVΔTKΔN1L-mIL21 相比 VVΔTKΔN1L-RFP 和 PBS组,其脾脏CD4+T细胞占CD3+T细胞比例显著下降,同时CD8+T所占比例显著升高,VVΔTKΔN1L-mIL21治疗改变了小鼠脾细胞CD4+T和CD8+T细胞亚群的比例。4.病毒治疗后D7天,两病毒治疗组脾脏Tem-CD4和Tem-CD8均显著高于PBS 组;第14天和第20天,VVΔTKΔN1L-mIL21 相比VVΔTKΔN1L-RFP和PBS组,其脾脏Tcm-CD8显著升高。5.病毒治疗后第20天,VVΔTKΔN1L-mIL21治疗组小鼠相比PBS组,CMT93-MMC、B8R刺激小鼠脾细胞后分泌的IFN-y显著升高。结论VVΔTKΔN1L-mIL21治疗改善了皮下瘤免疫微环境,促进脾脏免疫记忆细胞的形成。第3部分新型溶瘤痘苗病毒治疗结肠癌细胞系CT26肝转移模型及其机制的研究目的研究新型溶瘤痘苗病毒经静脉注射到达远端肿瘤的能力及对CT26转移瘤的治疗效果和潜在机制。方法1.小鼠结肠癌细胞系CT26经脾注射建立肝转移模型,模型建立后第5、7、9天肝组织HE染色检测确定CT26肿瘤细胞有无肝部定植,模型建立后3、4、5周B超检测肿瘤肝部生长情况。2.建立CT26肝转移模型,模型建立当天记为D0天,并于D7、D9、D11、D21、D23、D25 分别用 PBS 125 μL/鼠、VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21各2×108 PFU/125μL/鼠进行治疗。统计各组小鼠生存时间,绘制小鼠生存曲线。3.建立CT26肝转移模型,模型建立当天记为D0天,并与D7、D9、D11对各组小鼠进行治疗,D14、D18天分别收集各组小鼠肝脏、脾、淋巴结、血清、血液等进行各指标检测。4.组化检测小鼠肝脏组织冰冻切片CD4+T、CD8+T浸润,检测痘苗病毒衣壳蛋白。5.流式分析淋巴结和脾脏中T细胞亚群比例的变化。6.ELISA检测小鼠血清mIL21的含量。结果1.小鼠结肠癌细胞系CT26经脾注射建立肝转移模型很稳定。2.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒相比PBS治疗CT26肝转移模型,均取得很好的疗效,延缓肿瘤的发展。3.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒能够通过血液循环达到肝部肿瘤发挥溶瘤作用。4.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒的治疗重塑了CT26肝转移肿瘤的微环境,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润,小鼠淋巴结和脾脏T细胞亚群发生改变。结论VVΔTKΔN1L-mIL21能够通过血液循环到达肝部肿瘤发挥作用,延缓CT26转移瘤的发展,重塑CT26肝转移肿瘤的微环境。