针对单一的细胞途径治疗缺血性脑损伤效果并不令人满意,将脑组织的结构和功能单位进行整体保护被认为是有效的治疗策略,即保护“脑神经血管单元”。“脑神经血管单元”是由微血管(这些血管的内皮-基质-星形细胞足突复合体是一个完整的部分)、血管周围的星形细胞突起及由这些突起所支持的神经元以及轴突共同组成的复合体。建立原代3细胞共培养的“脑神经血管单元”体外模型,对于研究和筛选治疗缺血性脑损伤新药意义重大。目的1.构建大鼠脑微血管内皮细胞、脑星形胶质细胞、脑神经元3种脑细胞原代共培养的整体--“脑血管神经单元”体外试验模型,用于脑血管疾病的研究和治疗药物的筛选。2.利用“脑血管神经单元”体外试验模型,观察梓葛冻干粉针对“脑神经血管单元”的缺血缺氧损伤的整体保护效果,为创制中药新药提供主要药效学依据。方法1.借鉴并改良国外方法,分别进行大鼠脑微血管内皮细胞、脑星形胶质细胞、脑神经元3种脑细胞原代单细胞培养,方法如下。(1)分离新生2周左右的SD大鼠乳鼠脑皮层血管内皮细胞,通过Ⅱ行胶原酶和胰酶配合使用消化组织细胞,25%牛血清白蛋白分离血管段,采用消化传代法纯化,免疫细胞化学和免疫荧光法检测内皮细胞特异性蛋白Ⅷ因子以鉴定细胞纯度。(2)分离新生1-2d内的SD大鼠脑星型胶质细胞,采用胰酶消化发获得细胞,差速粘附法和振荡培养法去除杂细胞以及免疫细胞化学和免疫荧光法检测星形胶质细胞特异性酸性胶质纤维蛋白GFAP以鉴定细胞纯度。(3)分离新生24 h内的SD新生鼠脑皮质神经元细胞,采用胰酶消化法和阿糖胞苷抑制剂来抑制杂细胞的生长而纯化神经元细胞,后利用免疫细胞化学和免疫荧光鉴定神经元特异性烯醇化物酶NSE以鉴定细胞纯度。2、借鉴并改良国外方法,建立由上述3种脑细胞共培养所组成的共同体——“脑神经血管单元”模型,选用直径12 mm、微孔孔径0.4μm、微孔膜而积1.12 mm2的Transwell(12孔,No 3401,Corning)小室或者直径24 mm、微孔孔径0.4μm、微孔膜面积4.67 mm2的Transwell(6孔,No.3412,Corning)种植3种细胞,分别于孔板底部最先接种已纯化生长7 d的神经元,2 d后于膜的外侧依靠张力作用接种传代纯化后的星形胶质细胞,2 d后于膜的内池接种的传代纯化后的血管内皮细胞,相同条件下共培养7 d后。并通过以下指标鉴定“脑血管神经单元”体外模型：倒置显微镜观察3种细胞的生长状态、透射电镜观察模型内皮细胞间的精密连接、荧光素钠(FLU)和辣根过氧化物酶(HRP)检测模型的通透性以及外排系统γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)以及细胞跨膜电阻(TEER)。3、构建“脑神经血管单元”缺氧缺糖损伤,并通过以下指标观察梓葛冻干粉对其损伤的整体保护作用,检测指标包括：westerblot检测促红细胞生成素(EPO)和促红细胞生成素受体(EPOR)以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)、轴突生长蛋白(GAP-43)、髓过氧化物酶(MPO)、细胞间赫附分子-1(ICAM-1)、白细胞介素1(IL-1α)、金属基质酶9(MMP-9)和核因子(NF-κB)P65和(IKB-α)蛋白和神经修复相关蛋白(TGF-β1)的表达。免疫酶联ELISA法检测神经细胞生长因子β(NGFβ)和炎症因子如肿瘤细胞坏死因子(TNF-α)等。结果1、经鉴定证明3种脑细胞分别原代培养成功。(1)成功分离获得原代脑血管内皮细胞,传至3代后免疫细胞化学鉴定Ⅷ因子阳性细胞胞浆成棕黄色,计算得纯度达95%,符合神经元原代培养实验要求。(2)成功分离获得原代脑星形胶质细胞,经差速贴壁法结合振荡摇瓶法处理后传至3代后免疫细胞化学鉴定GFAP阳性细胞胞浆成棕黄色,纯度达90%,符合星形胶质细胞原代培养实验要求。(3)成功分离获得原代脑神经元细胞,经阿糖胞苷纯化后免疫细胞化学鉴定NSE阳性细胞胞浆成棕黄色纯度达85%,符合血管内皮细胞原代培养实验要求。2.试验结果显示3种脑细胞共培养生长良好,并且具有相互促进生长的作用。经检测以下指标鉴定证明“脑神经血管单元”体外模型成功建立。荧光素钠(FLU)和辣根过氧化物酶(HRP)通透性分别达到4632±168.79,3.62±0.14：细胞跨膜电阻(TEER)值为268.67±4.16(Ωcm2)；细胞外排系统γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)活性为155.33±0.80。相关检测指标均符合参考血脑屏障模型评价标准。透射电镜结果显示血管内皮细胞存在精密连接。3.梓葛冻干粉对缺氧缺糖损伤的“脑神经血管单元”中的炎症因子肿瘤细胞坏死因子(TNF-α)、细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)、白细胞介素1(IL-1)、金属基质酶9(MMP-9)具有显著的下调作用(P<0.05)；能显著促进脑微血管内皮红细胞生成素及其受体(EPO、EPOR)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白表达(P<0.05)；显著抑制核因子(NF-κB)P65和神经修复相关蛋白(TGF-β1)以及细胞凋亡蛋白(casepse-3)的表达(P<0.05)；显著提高NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)表达。结论1.通过分离和原代培养SD大鼠乳鼠脑皮层血管内皮细胞、星型胶质细胞和神经元细胞,成功建立了3种脑细胞共同培养体。经相关指标检测鉴定,3种脑细胞共同培养体具有“脑神经血管单元”的主要功能和细胞之间的相关信息,证明所建模型可作为“脑神经血管单元”的体外试验模型。2.梓葛冻干粉针剂对缺氧缺糖损伤的“脑神经血管单元”体外模型具有显著的保护作用。