线粒体活性氧(reactive oxygen species, ROS)爆发导致线粒体损伤进而引起心肌细胞凋亡是心肌缺血／再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤的关键环节。特别是再灌注早期,积极调控线粒体氧化应激平衡是防治心肌I/R损伤的关键。缺血后处理(isehemic postconditioning, IPC),即心肌缺血后在再灌注前对缺血心肌反复短暂缺血再灌注处理,是迄今已知最强的缺血心肌内源性保护方法。由于可在不可预见的心肌缺血后再灌注期间进行,IPC具有良好的临床应用前景。然而,IPC机制目前并不十分清楚。细胞膜和线粒体缝隙连接蛋白(connexin, Cx)43与心肌缺血再灌注损伤及氧化应激密切相关。假设细胞膜和线粒体Cx43介导的氧化应激平衡是缺氧后处理(hypoxia postconditioning, HPC)和IPC心脏保护效应的重要因素。本研究分三部分内容。首先,我们建立离体心肌细胞缺氧／复氧(Hypoxia/reoxygenation, H/R)和大鼠在体I／R损伤模型,实施HPC和IPC,在离体细胞和在体动物水平观察后处理对心肌细胞凋亡的影响。结果显示HPC和工PC显著减轻H/R及I/R诱导的心肌细胞凋亡及心肌损伤。接着,我们从细胞膜和线粒体水平探讨后处理抗心肌细胞凋亡机制,发现HPC和IPC显著抑制线粒体活性氧爆发,上调心肌细胞及组织线粒体和细胞膜Bc1-2蛋白,下调Bax蛋白。在此基础上以氧自由基清除剂超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)及热休克蛋白90(heat shock protein90, Hsp90)抑制剂格尔德霉素(geldanamycin, GA)干预,以探讨后处理过程中线粒体氧化应激平衡对心肌细胞凋亡的影响。发现单独应用SOD或CAT不影响HPC和IPC抗凋亡作用,而二者联合及单独应用GA则减弱HPC和IPC抗凋亡作用,揭示线粒体ROS在HPC和IPC的心脏保护中发挥重要作用。最后,为了阐明HPC和IPC是如何调控ROS的生成来发挥心脏保护作用,我们采用RNA干扰技术将Cx43mRNA在转录水平沉默,构建Cx43低表达SD大鼠离体心肌细胞H/R模型及活体I/R模型,观察Cx43低表达对HPC和TPC线粒体ROS产生及心肌细胞凋亡的影响。结果显示Cx43低表达明显减少HPC和IPC线粒体ROS,增加心肌细胞凋亡,提示Cx43低表达取消或减弱了HPC和工PC的心肌保护作用,揭示线粒体和细胞膜Cx43调控的氧化应激平衡在缺氧及缺血后处理心脏保护中发挥重要作用。第一部分后处理对缺氧复氧及缺血再灌注心肌保护作用研究目的建立有效的HPC和IPC心脏保护方法,在离体细胞和在体动物水平观察后处理对心肌细胞凋亡的影响。方法本研究分离体细胞和在体动物实验两部分：1.建立离体心肌细胞H/R损伤模型,将细胞分为对照组、H/R组(缺氧3h后复氧6h). HPC组(缺氧3h后行复氧／缺氧5min,反复3次,再复氧6h),应用Hoechst染色、流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。2.建立大鼠在体I/R损伤模型,24只大鼠随机分为假手术组(冠状动脉只穿线,不结扎)、I/R组(冠状动脉前降支缺血30min后再灌注2h)、IPC组(冠状动脉前降支缺血30min后行再灌注/缺血30s,反复3次,然后再灌注2h),通过心电图、心肌酶学及病理组织切片评价后处理的效果,应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果与对照组比较,H/R组、HPC组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)；与H/R组比较,HPC组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)；与假手术组比较,I/R组、IPC组心肌细胞凋亡数及心肌LDH、CK-MB明显升高(P<0.05)；与I/R组比较,IPC组心肌细胞凋亡数及血清LDH、CK-MB明显降低(P<0.05)。结论离体心肌细胞和在体大鼠水平显示：HPC和IPC显著减轻H/R及I/R诱导的心肌细胞凋亡及心肌损伤。第二部分后处理中线粒体氧化应激平衡对心肌细胞凋亡的影响及其机制研究目的1.探讨后处理抗H/R及工/R心肌细胞凋亡的机制。2.观察氧自由基清除剂SOD、CAT和Hsp90抑制剂GA对后处理抗凋亡效应的影响,探讨后处理中线粒体氧化应激平衡对细胞膜和线粒体Bc1-2和Bax蛋白调控心肌细胞凋亡的作用。方法本研究分四部分内容：1.建立离体心肌细胞缺氧／复氧损伤模型,将细胞分为对照组、H/R组、HPC组,通过差速离心制备心肌细胞线粒体和细胞膜蛋白,应用荧光探针测定心肌细胞线粒体活性氧,Western blot检测心肌细胞线粒体和细胞膜Bcl-2和Bax蛋白表达。2.建立大鼠在体缺血／再灌注损伤模型,24只大鼠随机分为假手术组、I/R组、IPC组,制备心肌组织线粒体和细胞膜蛋白,应用荧光探针测定心肌组织线粒体活性氧,Western blot检测心肌组织线粒体和细胞膜Bc1-2和Bax蛋白表达。3.心肌细胞缺氧3h后,分别进行：(1)复氧5min、缺氧5min,反复3次,再复氧6h(HPC组),(2)应用SOD100U/mL后立即进行(1)的操作(SOD+HPC组),(3)应用CAT120U/mL后立即进行(1)的操作(CAT+HPC组),(4)应用SOD联合CAT后立即进行(1)的操作(SOD+CAT+HPC组),(5)应用GA lumol/L后立即进行(1)的操作(GA+HPC组),应用荧光探针测定心肌细胞线粒体活性氧,应用Hoechst染色、流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Western blot检测心肌细胞线粒体和细胞膜Bc1-2和Bax蛋白表达。4.40只SD大鼠随机分为5组,行冠状动脉前降支缺血30min后分别进行：(1)3个循环再灌注30s、缺血30s后处理,然后再灌注2h(IPC组)：(2)再灌注前15min腹腔注射SOD30000U/kg,进行(1)的操作(SOD+IPC组)；(3)再灌注前15min腹腔注射CAT30000U/kg,进行(1)的操作(CAT+IPC组)；(4)再灌注前15min腹腔注射SOD联合CAT后,进行(1)的操作(SOD+CAT+IPC组)；(5)再灌注前15min腹腔注射GA0.6mg/kg,进行(1)的操作(GA+IPC组),应用荧光探针测定心肌组织线粒体活性氧,末端原位标记法检测心肌细胞凋亡,Western blot检测心肌组织线粒体和细胞膜Bc1-2和Bax蛋白表达。结果1.心肌细胞线粒体活性氧H/R组(61.53±4.73)显著升高,分别是对照组(13.25±1.07)和HPC组(32.72±2.86)的4-5倍和2倍(P均<0.01), SOD+HPC组(23.05±1.13)、CAT+HPC组(23.82±1.88)、SOD+CAT+HPC组(16.58±0.74)和GA+HPC组(17.52±1.02)较HPC组明显降低(P均<0.01),SOD+HPC组与CAT+HPC组比较无统计学意义(P>0.05)。心肌细胞凋亡率SOD+CAT+HPC组[(44.60±3.12)%]和(?)GA+HPC组[(45.65±3.71)%]显著高于HPC组[(26.42±2.96)%]、SOD+HPC组[(26.01±4.24)%]和CAT+HPC组[(26.98±3.66)%],P均<0.01,HPC组、SOD+HPC组和CAT+HPC组比较无统计学意义(P>0.05)。心肌细胞线粒体和细胞膜Bcl-2蛋白在HPC组、SOD+HPC组和CAT+HPC组显著上调(P均<0.01),Bax蛋白则显著下调(P均<0.01)；H/R组、SOD+CAT+HPC组和GA+HPC组Bcl-2蛋白显著下调(P<0.01), Bax蛋白显著上调(P均<0.01)。2.心肌组织线粒体活性氧工/R组(72.26±4.01)较假手术组(15.45±2.21)和IPC组(35.59士3.49)显著升高(P均<0.01)；SOD+IPC组(23.26±2.03), CAT+IPC组(25.03±2.59), GA+IPC组(17.77±1.42)和SOD+CAT+IPC组(16.21±1.62)较IPC组显著降低(P均<0.01), SOD+IPC组与CAT+IPC组比较无统计学意义(P>0.05)。心肌细胞凋亡数SOD+CAT+IPC组[20.6±2.5)个／视野]和GA+IPC组[(23.4±2.3)个／视野]显著高于IPC组[(12.3±2.4)个／视野]、SOD+IPC组[(13.3±2.3)个／视野]和CAT+IPC组[(13.0±1.6)个／视野],P均<0.05, IPC组、SOD+IPC组和CAT+IPC组比较无统计学意义(P>0.05)。心肌组织线粒体和细胞膜Bc1-2蛋白在IPC组、SOD+IPC组和CAT+IPC组显著上调(P均<0.01),Bax蛋白则显著下调(P均<0.01)；I/R组、SOD+CAT+IPC组和GA+IPC组Bc1-2蛋白显著下调(P<0.01), Bax蛋白显著上调(P均<0.01)。结论后处理抑制线粒体活性氧爆发,减轻缺氧／复氧及缺血／再灌注心肌细胞凋亡,其抗凋亡机制可能与线粒体和细胞膜Bc1-2蛋白表达上调和Bax蛋白表达下调有关；单独应用SOD或CAT不影响后处理抗凋亡作用,而二者联合及应用格尔德霉素则减弱后处理抗凋亡作用；线粒体活性氧在后处理的心脏保护作用发挥重要作用。第三部分线粒体和细胞膜缝隙连接蛋白43调控的氧化应激平衡在后处理中的作用研究目的探讨线粒体和细胞膜Cx43调控的氧化应激平衡对缺氧和缺血后处理心脏保护作用的影响。方法本研究分四部分内容：1.Cx43正常表达在缺氧后处理心肌保护中的作用。建立离体心肌细胞缺氧／复氧损伤模型,心肌细胞缺氧3h后,分别进行：(1)复氧6h(H/R组),(2)复氧5min、缺氧5min,反复3次,再复氧6h(HPC组),(3)应用SOD100U／mL后立即进行(2)的操作(SOD+HPC组),(4)应用CAT120U/mL后立即进行(2)的操作(CAT+HPC组),(5)应用SOD联合CAT后立即进行(2)的操作(SOD+CAT+HPC组),(6)应用GA5umol/mL后立即进行(2)的操作(GA+HPC组)。对照组心肌细胞在复氧条件下培养9h。通过荧光定量PCR法测定细胞Cx43mRNA表达,并差速离心制备心肌细胞线粒体和细胞膜蛋白,应用Western blot检测心肌细胞线粒体和细胞膜总Cx43(TCx43)和磷酸化Cx43(P Cx43)蛋白表达。2.Cx43正常表达在缺血后处理心肌保护中的作用。建立大鼠在体缺血／再灌注损伤模型,56只SD大鼠随机分为7组,行冠状动脉前降支缺血30min后分别进行：(1)再灌注2h(I/R组)；(2)3个循环再灌注30s、缺血30s后处理,然后再灌注2h (IPC组)：(3)再灌注前15min腹腔注射SOD30000U/kg,进行(2)的操作(SOD+IPC组)；(4)再灌注前15min腹腔注射CAT30000U/kg,进行(2)的操作(CAT+IPC组)；(5)再灌注前15min腹腔注射SOD联合CAT后,进行(2)的操作(SOD+CAT+IPC组)；(6)再灌注前15min腹腔注射GA0.6mg/kg,进行(2)的操作(GA+IPC组)。假手术组冠状动脉只穿线,不结扎。通过荧光定量PCR法测定组织Cx43mRNA表达,应用Western blot检测心肌组织线粒体和细胞膜总Cx43和磷酸化Cx43蛋白表达。3.RNA干扰心肌细胞Cx43表达对缺氧后处理心肌保护作用的影响。建立Cx43低表达离体心肌细胞缺氧／复氧损伤模型,通过荧光定量PCR和Western blot验证Cx43基因沉默效果。将细胞分为对照组、阴性对照组(转染pGCFu-RNAi-NC-LV, NC组)、Cx43正常表达HPC组(Cx43-HPC组),Cx43低表达HPC组(转染Cx43一RNAi-LV后进行HPC,iCx43-HPC组),通过差速离心制备心肌细胞线粒体和细胞膜蛋白,应用荧光探针测定心肌细胞线粒体活性氧,应用Hoechst染色、流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Western blot检测心肌细胞线粒体和细胞膜Bc1-2和Bax蛋白表达。4.RNA干扰心肌组织Cx43表达对缺血后处理心肌保护作用的影响。建立Cx43低表达大鼠在体缺血／再灌注损伤模型,并通过荧光定量PCR和Western blot验证Cx43基因沉默效果。32只SD大鼠随机分为4组,(1)假手术组(Sham,冠状动脉只穿线,不结扎)；(2)Cx43正常表达IPC组(Cx43一IPC组,冠状动脉前降支缺血30min后进行3个循环缺血30s,再灌注30s后处理,然后再灌注2h)；(3)Cx43低表达IPC组(iCx43一IPC组,大鼠心肌转染Cx43一RNAi-LV后,行冠状动脉前降支缺血30min,然后再灌注30s,缺血30s,反复3次,再灌注2h)；(4)阴性对照组(NC组,大鼠心肌转染pGCFu-RNAi-NC-LV后,冠状动脉只穿线,不结扎)。应用荧光探针测定心肌组织线粒体活性氧,末端原位标记法检测心肌细胞凋亡,Western blot检测心肌组织线粒体和细胞膜Bc1-2和Bax蛋白表达。结果1.与对照组比较,HPC组、SOD+HPC组和CAT+HPC组心肌细胞Cx43的mRNA.线粒体和细胞膜TCx43与PCx43蛋白表达量显著上调(P均<0.01), H／R组、SOD+CAT+HPC组和GA+HPC组Cx43的mRNA、心肌细胞线粒体和细胞膜TCx43与PCx43蛋白表达量显著下调(P均<0.01)。2.与假手术组比较,IPC组、SOD+IPC组和CAT+IPC组心肌组织Cx43的mRNA、线粒体和细胞膜TCx43与PCx43蛋白表达量显著上调(P均<0.01), I／R组、SOD+CAT+IPC组和GA+工PC组Cx43的mRNA.线粒体和细胞膜TCx43与PCx43蛋白表达显著下调(P均<0.01)。3.心肌细胞凋亡率i Cx43-HPC组(31.46±3.35)%显著高于对照组(4.68±1.45)%,阴性对照组(5.51±1.53)%和Cx43-HPC组(20.11±2.84)%；心肌细胞线粒体活性氧iCx43-HPC组(16.78±2.05)较对照组(10.95±1.82)和阴性对照组(11.76±2.3)有所升高,但显著低于Cx43-HPC组(30.67±2.08)(P均<0.01)；心肌细胞线粒体和细胞膜Bc1-2蛋白在Cx43-HPC组显著上调(P<0.01), Bax蛋白则显著下调(P<0.01)； iCx43-HPC组Bc1-2蛋白显著下调(P <0.01), Bax蛋白显著上调(P<0.01)。4.心肌细胞凋亡数i Cx43-IPC组(23.5±2.8)个／视野,显著高于假手术组(1.5±0.6)个／视野,阴性对照组(1.7±0.5)个／视野和Cx43-IPC组(12.3±2.4)个／视野；心肌组织线粒体活性氧iCx43-IPC组(15.74±1.00)较假手术组(10.65±0.96),阴性对照组(10.82±0.78)有所升高,但显著低于Cx43-IPC组(31.99±1.02)(P均<0.01)；心肌组织线粒体和细胞膜Bc1-2蛋白在Cx43-IPC组显著上调(P均<0.01),Bax蛋白则显著下调(P均<0.01)；iCx43-IPC组Bc1-2蛋白显著下调(P<0.01),Bax蛋白显著上调(P均<0.01)。结论线粒体和细胞膜Cx43调控的氧化应激平衡在缺氧及缺血后处理心脏保护中发挥重要作用。