论文部分内容阅读
缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH），发病机制目前尚不清晰，缺氧性肺血管收缩（hypoxic pulmonaryartery vasoconstriction,HPV）和缺氧性肺血管重建（pulmonaryvascular remodeling，PVR）是其两大病理基础。肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs）增殖凋亡失衡所致的肺血管重建成为研究热点，也是缺氧性肺动脉高压发生发展的核心，当前大多数治疗肺动脉高压的药物多强调扩张肺动脉，而对已经形成的肺动脉高压来说，此时的主要病理改变是PASMCs过度增殖或凋亡受阻，扩血管药物对已经发生重塑的肺动脉来说，所起的作用是微乎其微的，且这种扩血管作用对肺循环无特异性，导致目前肺动脉高压治疗效果差，死亡率居高不下。而作为凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins, IAP）成员之一的Survivin在大多数肿瘤组织中高表达，而在分化成熟正常组织中不表达，通过如SMAC通路、P21通路及线粒体/细胞色素C通路等，发挥抗凋亡作用，造成细胞增殖过度形成肿瘤。那么Survivin在HPH的肺组织中是否有表达或表达高低，其机制是如何的呢，这是我们研究的重点。同时，已有研究表明慢性缺氧条件下，缺氧可抑制PASM Cs电压门控钾电流（KV），缺氧一方面抑制KV的开放，引起PAS MCs膜电位降低，使PASMCs去极化，达一定阈值后电压依赖性钙通道开放，胞浆内游离钙浓度（[Ca2+]i）升高，导致肺血管收缩。慢性缺氧导致PASMCs膜KV受抑制，通过增加细胞内钙离子浓度，引起PASMCs增殖与凋亡受租， KV受抑后，细胞内K+浓度升高，导致Caspases活性下降，从而引起PASMCs凋亡受阻，从以上研究可以看出Kv同时调控PASMCs的增殖与收缩。那么，Survivin和Kv之间是否具有协同作用，协同机制又是什么样，缺氧条件下Kv的功能又是如何变化的，是我们研究的另一重点。基于此，本研究从离子通道水平、基因蛋白表达水平，阐明Survivin在慢性缺氧性肺动脉高压发生发展中所起的作用及其细胞内机制，为HPH发病机制提供基础资料。将18只雄性Wistar大鼠随机数字表法分为对照组（C组）、缺氧4周组（H组）、缺氧+给药YM155（小分子Survivin拮抗剂，HY组）组，每组6只，观察YM155对大鼠肺动脉平均压(mPAP)、右心室质量(RV)和左心室+室间隔(LV+S)质量的影响；采用免疫组织化学的方法,观察Survivin、Kv1.5及Kv2.1在三组大鼠肺组织中的表达及分布特点；采用实时荧光定量PCR分析三组大鼠肺组织中SurvivinmRNA的表达水平及肺动脉平滑肌Kv1.5mRNA和Kv2.1mRNA的表达水平；运用蛋白免疫印迹技术分析三组大鼠肺动脉平滑肌Kv1.5及Kv2.1蛋白表达情况。结果示：(1)经过4周慢性缺氧后， H组大鼠的mPAP(C组：16.20±0.70vsH组29.40±1.70,P<0.01)、RV质量(C组：0.15±0.01vsH组:0.29±0.02,P<0.01)、 RV/(LV+S)（C组：0.21±0.01vsH组：0.49±0.02，P<0.01)均高于对照组,显示HPH动物模型复制成功。(2)经YM155处理后,缺氧组大鼠mPAP(29.4±1.7)mmHg降至(19.6±1.3)mmHg， RV质量从(0.29±0.02)g降至(0.19±0.02)g(P<0.01)。(3)C组大鼠,无论是近端肺动脉,还是远端肺动脉,Survivin均不表达。而在H组,Survivin在肺内小动脉(直径60～200μm)呈高表达(P<0.01),且主要位于中膜,而在近端肺动脉,即中型肺动脉(200～500μm)和大型肺动脉(500～1000μm),Survivin无明显表达。H组小型肺动脉Survivin的阳性表达程度A值（平均吸光度值，A值）较C组显著增加（C组:0.0013±0.0005vs H组:0.2683±0.0239，P<0.01）。经YM155处理后,HY组大鼠肺内小肺动脉Survivin的表达强度(A值)明显减弱（H组：0.2683±0.0239vs0.0018±0.0004,P<0.01）。(4) H组大鼠肺组织Survivin mRNA表达水平明显高于C组大鼠(C组1.00vsH组：27989.55±15130.29，P<0.01),YM155处理后,HY组大鼠肺组织Survivin mRNA表达水平明显下降(H组：27989.55±15130.29vsHY组:5406.11±1554.20，P <0.01)。(5)①Kv1.5在三组大鼠肺动脉平滑肌上表达的比较：H组Kv1.5mRNA(0.40±80.091)表达明显低于C组（1.000）的表达（P<0.05）；H组Kv1.5蛋白(0.204±0.026)表达明显低于C组（0.410±0.029）的表达（P<0.05）；与H组比较，HY组Kv1.5mRNA（3.643±0.684）表达明显上调（P<0.05）；HY组Kv1.5蛋白（0.388±0.014）表达亦上调（P<0.05）②Kv2.1在三组大鼠肺动脉平滑肌上表达的比较：H组Kv2.1mRNA(0.450±0.149)表达明显低于C组（1.000）的表达（P<0.05）；H组Kv2.1蛋白(0.228±0.021)表达明显低于C组（0.85±00.073）的表达（P<0.05）；与H组比较，HY组kv2.1mRNA（3.433±0.537）表达明显上调（P<0.05）；HY组Kv2.1蛋白（0.87±10.078）表达亦上调（P<0.05）。③在肺内小动脉上，H组Kv1.5、Kv2.1蛋白的表达要明显低于C组（P<0.05）H组Kv1.5蛋白A值：(0.0683±0.0017)，H组Kv2.1蛋白A值：(0.0536±0.0020)；C组Kv1.5A值：(0.0866±0.0031)，C组Kv2.1A值：(0.0754±0.0029），而HY组与C组表达水平接近（P>0.05）（HY组Kv1.5蛋白A值：(0.08395±0.0027)，HY组Kv2.1蛋白A值：(0.0723±0.0031）。通过上述实验结果证实：(1)Survivin在慢性缺氧肺组织中高表达,且主要位于肺内小动脉的中膜,小分子Survivin拮抗剂YM155可以降低mPAP、减轻右心室肥厚,逆转肺动脉高压。（2）慢性缺氧可以从转录、翻译水平抑制Kv1.5、Kv2.1在大鼠肺动脉平滑肌的表达。(3)Survivin的抑制剂YM155可以通过促进PASMCs的凋亡，改变了细胞内信号转导通路中的某些因子的表达，从而间接促进Kv的表达，说明Kv在Survivin介导的细胞凋亡机制中可能发挥重要作用。