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胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,预后相对较差,严重威胁人类健康。早期胃癌临床症状不典型,故多数患者确诊时已为进展期,这些患者预后较差,除手术治疗外,均需辅助内科化疗等后续治疗。胃癌的内科治疗主要包括化疗、免疫治疗和靶向治疗。但化疗有效率有限,而且毒副作用高,免疫治疗尚未寻找到胃癌特异性靶点而进展缓慢。靶向治疗已在乳腺癌、肺癌治疗中广泛采用,特别是曲妥珠单抗（trastuzumab）在乳腺癌治疗中已被广泛认可。鉴于靶向治疗的精准性,人们已开始探索靶向治疗在胃癌中的应用。本研究旨在以HER2蛋白为靶点,构建并合成融合基因工程蛋白,探讨其对HER2阳性胃癌细胞的杀伤效果。单克隆抗体是目前应用较广泛的靶向治疗药物,抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）是单抗发挥杀伤作用的重要机制,但单抗抗体分子量大,难以穿透肿瘤组织,这些弊端限制了单抗的应用,同时具有免疫杀伤作用的T细胞因表面缺乏与单抗结合的受体而不能被有效介导,从而削弱了机体对肿瘤的免疫反应。单链抗体（sc Fv）仅含有全抗的可变区片段,具有免疫源性小、分子量小、穿透力强的特点,因此是理想的肿瘤治疗靶向载体。CCL19是一类可趋化免疫细胞定向移动的小分子蛋白,可诱导T细胞、NK细胞、DC细胞等发挥抗肿瘤作用。IL7在T细胞的发育、分化及增殖过程中发挥着重要作用,可通过促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子分泌抑制多种实体瘤的生长。所以本研究设计了以人源HER2 sc Fv为靶向载体,连接免疫细胞趋化因子CCL19及介导T细胞活化的IL7,构建了抗HER2sc Fv-CCL19-IL7全基因序列的慢病毒载体,转染并筛选出稳定表达融合基因工程蛋白的HEK293T细胞株,并从其培养上清中成功获得目标蛋白。获得目标蛋白后,第二部分实验验证了抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HER2靶向性及生物学活性。第三部分实验为融合蛋白抗肿瘤疗效研究,选用高表达HER2蛋白的NCI-N87胃癌细胞和HER2阴性的SGC7901细胞分别给予不同剂量融合蛋白,观察其杀伤效果。同时建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,并建立胃癌移植瘤小鼠模型,给予抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白进行治疗,观察肿瘤体积变化,检测体内IFN-γ和IL-2细胞因子分泌水平,评价其体内抗肿瘤效果。第一部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白表达载体的构建及真核表达目的:构建抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的表达质粒并筛选出稳定表达融合基因工程蛋白的HEK293T稳定细胞株。方法:从Genbank数据库中检索到人CCL19 c DNA序列（gene ID6363）,目的基因大小294bp,人IL7 c DNA序列（gene ID 9606）,目的基因大小531bp,抗人HER2 sc Fv基因由本实验室制备的鼠抗人HER2单克隆抗体杂交瘤细胞株中的VH、VL基因,经过密码子优化及人源化合成获得。按照抗HER2 sc Fv基因-连接肽基因-CCL19基因-连接肽基因-IL7基因形式排列,并于整段基因合成序列的两端分别设置的XhoⅠ/HindⅢ酶切位点,全基因序列合成,合成后的基因序列亚克隆在pc DNA3.1载体中,经过XhoⅠ/HindⅢ内切酶的酶切反应,将HCI-pc DNA3.1质粒中的抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因连接到慢病毒表达载体质粒上,酶切检验目的基因片段大小,并回收测序无误后使用慢病毒转染的方式将目的基因转染至HEK293T细胞中,并用PURO筛选转染后的细胞,以获得稳定表达融合蛋白的HEK293T细胞体系。将筛选得到的高表达融合蛋白的HEK293T细胞大量扩增培养,提取培养上清内表达的融合蛋白,利用His标签,通过镍柱亲和层析纯化目标蛋白,并通过Western-blot检测该融合蛋白在HEK293T细胞培养上清中的表达情况。结果:1.通过基因工程技术,成功合成了抗HER2 scFv-CCL19-IL7全基因序列,并亚克隆在pc DNA3.1载体中,通过基因测序证明基因序列正确,无突变。2.成功构建含有抗HER2 scFv-CCL19-IL7全基因序列的慢病毒载体,并通过慢病毒转染的方式成功的将目的基因序列成功转染至HEK293T细胞中,并筛选出稳定表达抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HEK293T细胞株。3.Western blot检测到抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在HEK293T细胞培养上清中表达。第二部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白靶向性验证及生物活性分析目的:验证抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HER2靶向性及生物活性方法:以流式细胞术检测人NCI-N87胃癌细胞、SGC7901胃癌细胞中HER2蛋白表达情况;流式细胞术测定分析抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白抗HER2抗原靶向性及生物学活性;ELISA法测定纯化获得的融合蛋白中的IL7含量及生物学活性;测定抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的结合常数,证实抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白具有与HER2抗原亲和力,并具备生物活性,为进一步验证其体内外抗肿瘤研究奠定基础。结果:1.流式细胞术检测发现人NCI-N87胃癌细胞表面HER2蛋白呈高表达、SGC7901胃癌细胞表面HER2蛋白呈低表达或无表达。2.流式细胞术检测后分析荧光强度显示抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可与赫赛汀、HER2-FITC竞争性结合人胃癌NCI-N87细胞表面的HER2抗原。3.蛋白结合常数测定显示抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白具有与HER2抗原结合的抗体活性,具有一定亲和力。4.ELISA法检测到HEK293T细胞培养基中含有IL7,并且结果显示随着培养时间的延长,培养基中IL-7含量呈上升趋势。第三部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体内外抗肿瘤的实验研究目的:探讨抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在体外对HER2过表达胃癌细胞的杀伤效力及对HER2阳性胃癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:CCK-8法检测体外HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白介导PBMCs对HER2过表达及低表达胃癌细胞的杀伤作用;ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。鼠尾静脉注射人外周血单个核细胞构建人源化NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达情况。人源化NOD/SCID小鼠接种HER2过表达的NCI-N87人胃癌细胞建立胃癌移植瘤动物模型。成瘤后将动物随机分为三组,分别给予生理盐水、赫赛汀、抗HER2sc Fv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白初始负荷治疗量1次,维持治疗量3次,每周给药1次,共治疗4次,定期测量肿瘤体积变化,计算三组小鼠移植瘤平均体积和SD值。ELISA检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的分泌量。肿瘤标本进行病理切片,HE染色观察其形态,免疫荧光组化法观察肿瘤组织内T淋巴细胞、DC细胞的浸润情况。结果:1.不同效靶比下抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体外介导PBMCs对HER2阳性NCI-N87细胞及HER2阴性SGC7901细胞的杀伤效率随着效靶比的增加而明显提高。2.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可介导活化免疫细胞,增加IFN-γ和IL-2分泌量。3.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在体内对HER2阳性胃癌细胞杀伤效果显著。4.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可趋化T细胞、DC细胞等淋巴细胞向肿瘤内迁移。结论:1.携带抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的全基因序列,通过慢病毒转染的方式成功的转染至HEK293T细胞中,并可稳定表达抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白。2.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可特异性靶向肿瘤细胞表面的HER2蛋白,并具有抗体抗原结合活性。3.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可介导活化免疫细胞,增加IFN-γ和IL-2分泌量。4.通过鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并通过肿瘤细胞株皮下注射成功建立了胃癌移植瘤模型。抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可特异性识别HER2抗原,并通过趋化DC细胞,活化T细胞等途径介导免疫系统发挥抗肿瘤作用。