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报春花属(Primula)植物在景观及药用方面都具有很高的价值。四季报春(Primula obconica)生命力旺盛、抗性强,观赏价值高,多应用于盆栽观赏、春季布置花坛、花境等,是报春花属中应用较多的品种。虽然我国拥有丰富的野生种质资源,但许多还未被引种及应用,而原产我国的报春花已经成为欧美园林应用中的主要栽培品种。目前对四季报春选育新品种的工作开展迫在眉睫,而利用花药或花粉离体培养方法来诱导单倍体,进而培育出纯合的多倍体植株,这样不仅可以缩短育种年限,同时也能提高育种效率。本研究在了解到5种报春花属植物染色体数目及倍性的基础上,对四季报春花粉发育时期及影响花药培养的因素等方面展开研究。主要研究结果如下:
(1)通过采用根尖染色法,掌握了5种报春花属植物根尖细胞有丝分裂中期的染色体数目及核型,其中红宝石球花报春(Primula denticulata Cashmeriana Ruby)、欧报春(Primula vulgaris)、四季报春的核型为首次报道。红宝石球花报春,2n=2x=12m+6sm,核型为2A型;欧报春,2n=2x=18m+2sm,核型为2B型;胭脂花(Primula maximowiczii Regel),2n=2x=2M+20m,核型为1A型;四季报春,2n=2x=20m+2sm,核型为2A型;橘红灯台报春(Primula bulleyana),2n=2x=16m+6sm,核型为2A型。依据Stebbins的分类,胭脂花进化程度最低,相比较其余4种报春原始;红宝石球花报春、四季报春和橘红灯台报春这3种报春具有较近亲缘关系;5种报春核型对称程度较高,除了红宝石球花宝春核型不对称系数大于60%,其余均低于60%。
(2)通过分别对四季报春主花序及分枝上长柱头和短柱头不同花蕾长度进行发粉发育时期的测定,发现相同花柱及花蕾长度的主花序上的花蕾的花粉发育时期要稍提前于分枝上的,短花柱在各个发育时期都稍晚于长花柱,但差别不显著,二型花柱的四季报春的发粉发育时期有较高的同步性。当花蕾长为1.49~1.99mm时,花苞完全被花萼包被,花药黄绿色,基本为花粉发育的四分体时期;当花蕾长为2.00~2.99mm时,花萼稍松散,花药浅黄色,为花粉发育的高峰单核中期;当花蕾长为3.00~5.49mm时,花苞稍低、齐平或稍高于花萼,花药黄色,基本为花粉发育的单核靠边期;当花蕾长为5.50~6.99mm时,花苞高于花萼,花药深黄色,基本为花粉发育的双核期;当花蕾长为7.00~13.99mm时,花蕾即将开放,为三核期到成熟花粉粒时期。
(3)从四分体时期到双核期的花粉均可以诱导出愈伤组织,但当花粉处于单核靠边期时,诱导率最高为58.33%,涨幅约为四分体时期的1.4倍,此时期分化率也最高,且生长状况最好,为四季报春花药培养的最适期。
(4)在影响花药诱导产生愈伤组织的因素研究中:将采集的新鲜花蕾在流水下冲洗30min,浸润花药效果最好,在无菌操作台上用75%乙醇浸泡60s后,再用2%NaCl0浸泡5min,不仅能彻底杀死花蕾表面的微生物,还能保持小孢子的活性及减轻灭菌剂对花药的毒害,诱导率达到最高为66.67%;最适合诱导愈伤组织的培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.8mg/L6-BA,添加30g/L蔗糖,5g/L琼脂,诱导率最高,生长状况最好;以采集早期分化出来的花药进行培养为宜,接种时以整接为宜,接种花药粒数以在广口瓶中接种25粒为宜,接种后的花药先在15℃的低温培养箱中暗培养2d或在33℃的高温培养箱中暗培养1d后,置于25℃共进行30d的暗培养,再进行光培养更有利于愈伤组织的产生;随着活性炭浓度的增加和延长4℃低温预处理花蕾的时间,诱导率均呈下降趋势,与对照差别显著,均不利于四季报春花药诱导愈伤组织的培养。
(5)四季报春花药愈伤组织在MS+1.5mg/L NAA+0.8mg/L6-BA中分化不定芽的效果最佳。诱导出的不定芽存活数量较少,无法准确表示出单倍体植株的诱导率,故取花药诱导出的愈伤组织测定其倍性,其中单倍体仅占16%,其余多为双单倍体。
(1)通过采用根尖染色法,掌握了5种报春花属植物根尖细胞有丝分裂中期的染色体数目及核型,其中红宝石球花报春(Primula denticulata Cashmeriana Ruby)、欧报春(Primula vulgaris)、四季报春的核型为首次报道。红宝石球花报春,2n=2x=12m+6sm,核型为2A型;欧报春,2n=2x=18m+2sm,核型为2B型;胭脂花(Primula maximowiczii Regel),2n=2x=2M+20m,核型为1A型;四季报春,2n=2x=20m+2sm,核型为2A型;橘红灯台报春(Primula bulleyana),2n=2x=16m+6sm,核型为2A型。依据Stebbins的分类,胭脂花进化程度最低,相比较其余4种报春原始;红宝石球花报春、四季报春和橘红灯台报春这3种报春具有较近亲缘关系;5种报春核型对称程度较高,除了红宝石球花宝春核型不对称系数大于60%,其余均低于60%。
(2)通过分别对四季报春主花序及分枝上长柱头和短柱头不同花蕾长度进行发粉发育时期的测定,发现相同花柱及花蕾长度的主花序上的花蕾的花粉发育时期要稍提前于分枝上的,短花柱在各个发育时期都稍晚于长花柱,但差别不显著,二型花柱的四季报春的发粉发育时期有较高的同步性。当花蕾长为1.49~1.99mm时,花苞完全被花萼包被,花药黄绿色,基本为花粉发育的四分体时期;当花蕾长为2.00~2.99mm时,花萼稍松散,花药浅黄色,为花粉发育的高峰单核中期;当花蕾长为3.00~5.49mm时,花苞稍低、齐平或稍高于花萼,花药黄色,基本为花粉发育的单核靠边期;当花蕾长为5.50~6.99mm时,花苞高于花萼,花药深黄色,基本为花粉发育的双核期;当花蕾长为7.00~13.99mm时,花蕾即将开放,为三核期到成熟花粉粒时期。
(3)从四分体时期到双核期的花粉均可以诱导出愈伤组织,但当花粉处于单核靠边期时,诱导率最高为58.33%,涨幅约为四分体时期的1.4倍,此时期分化率也最高,且生长状况最好,为四季报春花药培养的最适期。
(4)在影响花药诱导产生愈伤组织的因素研究中:将采集的新鲜花蕾在流水下冲洗30min,浸润花药效果最好,在无菌操作台上用75%乙醇浸泡60s后,再用2%NaCl0浸泡5min,不仅能彻底杀死花蕾表面的微生物,还能保持小孢子的活性及减轻灭菌剂对花药的毒害,诱导率达到最高为66.67%;最适合诱导愈伤组织的培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.8mg/L6-BA,添加30g/L蔗糖,5g/L琼脂,诱导率最高,生长状况最好;以采集早期分化出来的花药进行培养为宜,接种时以整接为宜,接种花药粒数以在广口瓶中接种25粒为宜,接种后的花药先在15℃的低温培养箱中暗培养2d或在33℃的高温培养箱中暗培养1d后,置于25℃共进行30d的暗培养,再进行光培养更有利于愈伤组织的产生;随着活性炭浓度的增加和延长4℃低温预处理花蕾的时间,诱导率均呈下降趋势,与对照差别显著,均不利于四季报春花药诱导愈伤组织的培养。
(5)四季报春花药愈伤组织在MS+1.5mg/L NAA+0.8mg/L6-BA中分化不定芽的效果最佳。诱导出的不定芽存活数量较少,无法准确表示出单倍体植株的诱导率,故取花药诱导出的愈伤组织测定其倍性,其中单倍体仅占16%,其余多为双单倍体。