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肝纤维化(liver fibrosis)是慢性肝损伤后肝组织反复的自我愈合修复和间质重建过程,病理特征为肝细胞再生同时伴随显著的纤维发生和血管新生(angigenesis)。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在慢性肝损伤纤维发生和血管新生基质重建中起中起核心作用,肝星状细胞的活化是肝纤维化发生的中心环节,活化的肝星状细胞增殖性、迁移性和收缩性明显增加,同时合成大量细胞外基质(extrocelluralmatrix,ECM)聚集于Diss间隙,分泌多种促血管新生因子,进而促进了肝间质的重建。经典WNT/β-catenin信号通路是细胞外配体(WNT蛋白家族)在分子伴侣的协同下,通过与Frizzled(FZD4)家族特异性受体和低密度脂蛋白受体蛋白(LRP5/6)辅助结合下,触发细胞内信号转到,并抑制了下游蛋白复合体(包括抑癌基因、GSK-3β、Axin、A.PC等)这些β-catenin降解复合体合成。当β-catenin降解复合体被抑制后,β-catenin信号得以在胞浆内累积并传导至细胞核,与核内转录因子TCF/LEF1相互作用,调控与细胞生存、增殖、分裂、迁移、胞外基质合成与降解等相关靶基因的转录和表达。研究发现在活化的肝星状细胞中存在WNT/[3-catenin经典信号通路,与肝星状细胞的激活、肝纤维化的发生发展也存在着一定的关系,阻断该信号通路可有效抑制肝星状细胞活化,延缓慢性肝损伤纤维化过程。因此,Frizzled-4/LRP5可能是WNT/β-catenin经典信号通路中的关键因子,对Frizzled-4受体表达进行干预研究可为抗肝纤维化干预提供新的分子靶标。我们的前期研究发现龙血素和美洲大蠊提取物(PAE)在体内外有抗肝纤维化作用,但其细胞分子靶点不明确,是否通过Frizzled-4受体发挥也是本研究的主要目的。目的:探讨龙血素和美洲大蠊提取物(PAE)对活化的大鼠肝星状细胞中Frizzled-4受体表达和细胞增殖、间质重建血管细胞因子合成分泌的影响。方法:体外研究:分离SD大鼠的肝星状细胞,体外传代培养诱导细胞活化,用龙血素A/B和PAE干预肝星状细胞,MTT法计算抑制率,Elisa检测龙血素A/B对活化肝星状细胞培养上清液中TGF-β1、α-SMA和VEGF合成分泌的影响。经过RT-PCR和Western Blot分析,与对照组比较活化肝星状细胞中Frizzled-4受体和α-SMA的表达变化。体内研究:建立急性大鼠肝损伤模型,探讨硫代乙酰胺(TAA)诱导的急性肝损伤大鼠血清中血管新生相关细胞因子、肝损伤程度及肝脏组织中Norrin/Frizzled-4信号表达的影响的变化。结果:体外研究显示,与空白对照组比较,龙血素A/B和PAE均能抑制活化肝星状细胞增殖,并有显著的时间-剂量效应关系,龙血素干预后细胞培养上清液中 TGF-β1(P<0.05)、α-SMA(P<0.05)和 VEGF(P<0.01)分泌明显降低,同时龙血素在mRNA和蛋白水平下调肝星状细胞特异性受体Frizzled-4和活化标志物α-SMA的表达(P<0.05)。动物实验显示,硫代乙酰胺诱导急性肝损伤组大鼠血清中VEGF、CD105高于正常对照组;急性肝损伤大鼠肝组织细胞出现水肿、炎性坏死;Norrin/Frizzled-4信号蛋白在肝损伤组中的表达高于正常组(P<0.05)。结论:龙血素和PAE可有效抑制肝星状细胞增殖,龙血素可能通过抑制活化肝星状细胞增殖和分泌TGF-β1、VEGF等间质细胞活化因子,下调Frizzled-4受体表达和WNT/β-catenin信号通路,影响活化肝星状细胞活化表型维持,延缓肝纤维化进程。Frizzled-4受体在急性肝损伤组织中高表达,可能与其激活WNT/β-catenin信号通路,参与组织修复和间质重建相关。