论文部分内容阅读
子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)又称内异症,是一种常见的妇科疾病,虽然该病在组织学上为良性疾病,但却具有侵袭、转移、复发等恶性行为。1925年,Sampson首次报道了EMs可能是上皮性卵巢恶性肿瘤的癌前病变,子宫内膜异位症相关卵巢癌(Endometriosis-associated Ovarian Cancer,EAOC)的概念也随之提出。随着卵巢癌“二元发病模型”的提出和二代高通量测序技术的广泛应用,越来越多的研究证实,内异症是卵巢癌发生的危险因素,EAOC患者可能具有不同于其他上皮性卵巢恶性肿瘤的特征,且卵巢透明细胞癌(Ovarian Clear Cell Carcinoma,OCCC)和卵巢子宫内膜样腺癌(Ovarian Endometrioid Adenocarcinoma,OEC)是最常见的EAOC类型。但迄今为止,EAOC患者的临床病理特征及EMs与OCCC及OEC患者预后的相关性尚存争议,且EAOC的发病机制目前仍不十分清楚。本研究第一部分对256例OCCC和OEC患者的临床病理资料进行回顾性分析,旨在发现EAOC患者独特的临床病理特征及EMs对OCCC和OEC患者预后的影响。第二部分在第一部分研究基础上选取其中7例合并EMs及10例不合并EMs的OCCC患者石蜡包埋的癌组织,采用二代测序技术进行全外显子组测序,并以其自身石蜡包埋的正常卵巢组织作为对照,旨在发现EAOC患者的高频突变基因并加以初步验证,探索其在EAOC发病中的作用。第一部分子宫内膜异位症相关卵巢癌患者的临床特征目的探讨EAOC患者的临床病理特征及EMs对患者预后的影响。材料与方法选取2000年1月至2017年12月间就诊于浙江大学医学院附属妇产科医院妇科肿瘤科和浙江省肿瘤医院妇科的OCCC、OEC及以OCCC或OEC为主要成分的上皮性混合性卵巢癌的住院患者共256例,将其分为EAOC组和非子宫内膜异位症相关卵巢癌(Non-endometriosis-associated Ovarian Cancer,NEAOC)组,分析两组间临床病理特征及预后的差异。结果1.约有27.3%的OCCC和OEC患者合并EMs。2.与NEAOC组患者相比,EAOC组患者大部分为OCCC,多为单侧卵巢患病,临床FIGO分期较早,术后多无残余病灶且术前血清CA125多为正常水平或轻度升高。3.EAOC和NEAOC组患者的5年无进展生存率分别为83.3%和54.7%,两者间具有显著差异(p<0.001)。EAOC和NEAOC组的5年总生存率分别为89.7%和63.9%,两组患者间生存差异具有统计学意义(p=0.001)。结论1.与NEAOC组患者相比,EAOC患者多为透明细胞癌,FIGO分期多为早期,术后多无肉眼残余病灶,术前血清CA125水平多为正常水平或轻度升高。2.EMs可能是影响卵巢癌患者预后的因素之一。第二部分子宫内膜异位症相关卵巢癌发病机制的初步探讨目的探讨EAOC的可能发病机制并加以初步验证。材料与方法首先选取第一部分中7例合并EMs及10例不合并EMs的OCCC患者石蜡包埋的癌组织,采用全外显子组测序技术,以其自身石蜡包埋的正常卵巢组织作为对照,筛选EMs相关OCCC组织中的显著突变基因(Significantly Mutated Genes,SMG)。其次,根据全外显子组测序的结果,选择其中在合并EMs组中突变频率最高的两个基因ARID1A及PIK3CA,选取76例OCCC患者和9例OEC患者的石蜡包埋组织,采用免疫组化的方法对ARID1A、PIK3CA基因编码的蛋白(BAF250a和PIK3CA p110α)及PI3K下游通路分子进行验证,并分析BAF250a及PI3K通路相关蛋白在EAOC和NEAOC患者中的表达差异及其与患者临床病理特征、预后的关系。第三,利用体外实验对BAF250a蛋白进行细胞功能实验,首先在四株人卵巢癌细胞株(ES-2、HO-8910、A2780和TOV-21G)中验证BAF250a蛋白的表达,发现A2780和TOV-21G中BAF250a表达缺失,ES-2和HO-8910细胞株中BAF250a表达存在,故下一步在ES-2和HO-8910细胞株中使用慢病毒包装的sh RNA下调ARID1A基因的表达,使用RT-q PCR和Western Blot技术验证下调效果,CCK-8实验检测细胞增殖能力的改变。结果1.全外显子组测序结果共发现13个SMG可能与OCCC相关,其中有10/17位患者的组织中发生了ARID1A基因的体细胞突变,突变率为58.8%,且其中有5例(50%)为移码突变;其次为PIK3CA基因,有7例患者发生了PIK3CA基因的体细胞突变,突变率为41.2%,且均为错义突变。2.在7例合并EMs的OCCC患者中,有4例患者携带ARID1A基因的体细胞突变,突变率为57.1%,其中2例为移码突变,2例为无义突变;有4例患者携带PIK3CA基因的体细胞突变,突变率为57.1%,均为错义突变。3.免疫组化实验证实,在76例OCCC患者中,共有45例(59.2%)患者发生了BAF250a蛋白表达缺失,在EAOC和NEAOC患者中BAF250a蛋白表达缺失率无显著差异(69.6%vs.44.8%,p=0.062)。4.在9例OEC患者中,共有6例(66.7%)患者存在BAF250a蛋白表达缺失,在EAOC和NEAOC患者中BAF250a蛋白表达缺失率无显著差异(66.7%vs.57.1%,p=0.778)。5.在OCCC患者中,BAF250a蛋白表达缺失组和表达存在组的PFS(82.7%vs.79.5%,p=0.577)和OS(84.6%vs.89.4%,p=0.869)均无显著差异。6.在OCCC患者中,未发现EAOC和NEAOC两组患者的PI3K通路相关蛋白表达有显著差异。7.在OEC患者中,未发现EAOC和NEAOC两组患者的PI3K通路相关蛋白表达有显著差异。8.在人卵巢癌细胞株ES-2和HO-8910中下调ARID1A的表达,细胞增殖能力无明显改变。结论1.ARID1A、PIK3CA基因突变为EAOC中的高频事件。2.ARID1A表达的BAF250a蛋白在OCCC和OEC患者组织中存在广泛的表达缺失。3.ARID1A突变导致的BAF250a表达缺失可能是卵巢癌发生的早期分子事件,但是单独ARID1A突变可能不能导致癌症发生,需要结合其它基因变异。