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目的:程序性死亡蛋白1（PD-1）是免疫球蛋白基因超家族的负性共刺激受体,通过与其配体PD-L1/PD-L2结合可介导肿瘤细胞和病原体的免疫逃逸功能。uNK细胞是母胎界面最主要的免疫细胞群体,在妊娠期间可调节子宫内膜重塑和血管生成,对胚胎的生长发育起关键作用。孕期急性炎症前后,母胎界面PD-1/PD-L1通路的表达会有一定的波动,uNK细胞的亚群也有明显的改变,但在孕早期弓形虫急性感染妊娠模型中两者的相互调节作用尚不明确。因此本文通过建立孕早期弓形虫感染模型来探讨:PD-1在孕早期弓形虫感染小鼠中的动态表达情况,以及在弓形虫感染小鼠模型中和IFN-γ的相互调节作用和对uNK分化的影响作用。方法:1.孕早期急性弓形虫感染模型建立:将20只孕0天的母鼠随机分配为4 组,分别为孕 12 天对照组（12 days pregnant normal group,12 dpn 组）、感染组（12 days pregnant infected group,12 dpi 组）和孕 18 天对照组（18 days pregnant normal group,18 dpn 组）、感染组（18 days pregnant infected group,18 dpi组）,在孕6天时对两个感染组的孕鼠腹腔注射150只弓形虫Pru株速殖子以建立孕早期弓形虫感染模型,对照组腹腔注射等体积的PBS。待孕12天和孕18天时分别处死4组孕鼠,称量每只孕鼠的体重以及单个胎盘和胎儿的体重,初步衡量弓形虫感染对胚胎发育的影响。2.孕鼠子宫和胎盘病理检查:取12dpn、12dpi、18dpn和18dpi组孕鼠的子宫、胎盘等组织进行HE染色来观察弓形虫感染后组织的病理改变。3.PD-1等相关因子表达的检测与分析:采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测胎盘子宫组织中 PD-1、PD-L1、NKG2A、NKG2D、DAP10、弓形虫表面抗原SAG-1及细胞因子IFN-γ的mRNA表达水平,并分析PD-1与IFN-γ表达的相关性。4.免疫组化染色:采用免疫组织化学染色（IHC）检测子宫、胎盘组织中PD-1的定位。5.流式细胞术:检测胎盘和肝脏组织中NK细胞的毒性亚群在感染前后的动态改变,以及毒性NK细胞表面PD-1的表达情况以及分泌IFN-γ情况,初步衡量PD-1对uNK细胞分化及其与IFN-γ分子表达的调节作用。结果:1.孕早期弓形虫感染导致不良妊娠结局:未经弓形虫感染的孕鼠精神状态良好,而12 dpi和18 dpi感染组的孕鼠出现了典型的弓形虫感染后耸毛、弓背、精神萎靡的现象,个别感染组的孕鼠出现阴道出血和流产以及早产的现象,对孕鼠胚胎大体观进行观察发现对照组孕鼠胚胎发育良好,胎盘血供充足,且胎盘的大小均一,感染组小鼠则出现死胎、畸胎、吸收胎的情况,孕鼠和胚胎重量以及孕鼠流产率分别较同期正常组显著下降;2.弓形虫感染使孕鼠子宫和胎盘发生病理改变:组织病理观察结果显示,感染组孕鼠胎盘组织的蜕膜及连接区连接疏松且细胞排列紊乱,胎盘迷路区出现淤血、细胞水肿、纤维素样坏死且有大量炎性细胞浸润。感染组子宫黏膜柱状上皮细胞损伤严重,血管内红细胞减少,且有炎性细胞浸润。3.PD-1等相关因子表达的检测与分析:（1）弓形虫感染使PD-1、PD-L1和IFN-γ分子呈孕12天上升孕18天下降的表达趋势:经qPCR检测发现,12dpn、12dpi、18dpn组和18dpi组小鼠胎盘和子宫组织中 PD-1（F=22.48、51.23,P＜0.05）、PD-L1（F=9.61、47.49,P＜0.05）和IFN-γ（F=16.08、21.52,P＜0.05）的表达存在差异,其中12dpi组小鼠胎盘（P均＜0.05）及子宫组织中（P均＜0.05）中PD-1、PD-L1和IFN-γ表达水平均较12dpn组升高;与18dpn组相比,18dpi组小鼠胎盘组织中PD-1和PD-L1表达水平下降（P均＜0.05）而IFN-γ的表达水平均升高（P＜0.05）;与12dpi组相比,18dpi组孕鼠胎盘和子宫中PD-1和PD-L1和IFN-γ表达水平均下降（P均＜0.05）,以上结果说明弓形虫感染使PD-1、PD-L1和IFN-γ分子呈孕12天上升孕18天下降的表达趋势。（2）弓形虫感染使胎盘子宫组织中弓形虫特异性速殖子蛋白SAG-1的表达上升:经qPCR检测发现,12dpn、12dpi、18dpn组和18dpi组小鼠胎盘和子宫组织中SAG-1（F=28.66、238.90,P＜0.05）的表达存在差异,在小鼠胎盘以及子宫组织的12dpn和18dpn组中均未检测到SAG-1的表达,但是在12dpi和18dpi组检测到SAG-1的高表达,且与12dpi组相比,18dpi组SAG-1（P均＜0.05）的表达量下降,说明弓形虫感染使弓形虫特异性速殖子蛋白SAG-1的表达上升,且在孕12天时上升最为明显。（3）弓形虫感染使胎盘和子宫组织中NKG2A/2D表达失衡:在正常妊娠时,作为对胚胎发育有利的NKG2A受体在母胎界面呈高表达状态,而毒性相关受体NKG2D则呈现低表达水平,弓形虫感染使胎盘和子宫组织中NKG2A/2D表达失衡,经qPCR检测发现,12dpn、12dpi、18dpn和18dpi组小鼠胎盘和子宫组织中NKG2A/2D表达存在差异（F=27.59,24.26,P＜0.05）,相对于 12dpn,12dpi 组的 NKG2D（P＜0.05）和 DAP-10（P＜0.01）的表达量显著上升,然而相比12dpi,18dpi组的NKG2D（P＜0.05）和DAP-10（P＜0.01）的表达量下调,胎盘组织中NKG2A的表达量呈下降趋势（P＜0.05）,与同期对照组相比12dpi和18dpi组NKG2A的表达均上升（P＜0.05）。4.弓形虫感染使孕12天小鼠胎盘及子宫组织高表达PD-1分子:免疫组化染色结果显示,PD-1在12dpi组孕鼠胎盘组织中浸润的炎性细胞上有表达,在18dpi组中表达不明显;PD-1在12dpi组孕鼠子宫上皮呈强阳性表达,而在18dpi组呈弱阳性表达。相关性分析结果显示,12dpi组小鼠胎盘（rs=0.99,P＜0.01）、子宫（rs=0.97,P＜0.01）,18dpi 组小鼠胎盘（rs=0.82,P＜0.05）、子宫（rs=0.81,P＜0.05）中 IFN-γ与 PD-1 mRNA表达水平均呈正相关。5.流式细胞术:（1）弓形虫感染使胎盘和肝脏组织中毒性相关NK细胞比例上升:四组之间胎盘以及肝脏组织中的CD3-NK1.1+的NK细胞占淋巴细胞的比例有所改变（F=228.6,F=73.56,P＜0.0001）:在胎盘和肝脏组织中与12dpn组相比12dpi组小鼠的CD3-NK1.1+NK细胞的比例显著上升（P＜0.001,P＜0.0001）,18dpn 和 18dpi 组之间 CD3-NK1.1+NK 细胞的比例没有显著差异,但18dpn组NK细胞的比例与12dpn相比显著上调,（P均＜0.0001）,18dpi组NK细胞的比例与12dpi组相比也有所上升（P＜0.01）;检测胎盘和肝脏组织中DX5+CD3-NK1.1+NK细胞/CD3-NK1.1+NK细胞的比例,结果显示四组之间DX5+CD3-NK1.1+NK细胞/CD3-NK1.1+NK细胞的比例有显著的统计学差异（F=91.18,F=150.60,P＜0.0001）:与12dpn相比 12dpi 组 DX5+CD3-NK1.1+NK 的比例显著上升（P＜0.05,P＜0.0001）,胎盘组织中18dpi组DX5+CD3-NK1.1+NK的比例与18dpn组相比也有所上升（P＜0.05）,胎盘和肝脏组织中 18dpn 和 18dpi 组 DX5+CD3-NK1.1+NK的比例与12dpi组相比均显著下降（P＜0.01）。（2）弓形虫感染使胎盘和肝脏组织中孕中期毒性NK细胞亚群表面PD-1的表达水平上升:进一步观察胎盘和肝脏组织中CD3-NK1.1+DX5+PD-1+NK细胞的比例,发现四组之间胎盘和肝脏组织之间CD3-NK1.1+DX5+PD-1+NK的比例有统计学差异（F=39.87,F=14.51,P＜0.001）:其中12dpi组孕鼠胎盘以及肝脏组织之间CD3-NK1.1+DX5+PD-1+NK细胞的比例与12dpn组相比显著上升（P＜0.0001,P＜0.001）,胎盘组织中 18dpi 组 CD3-NK1.1+DX5+PD-1+NK细胞比例与18dpn组相比有所下调（P＜0.05）,但肝脏组织中18dpi组CD3-NK1.1+DX5+PD-1+NK细胞比例与18dpn组相比没有显著的统计学差异。（3）弓形虫感染使毒性NK细胞IFN-γ的分泌量增加:观察胎盘组织中CD3-NK1.1+DX5+IFN-γ+ NK细胞的比例,发现四组之间CD3-NK1.1+DX5+IFN-γ+ NK细胞的比例有统计学差异（F=54.22,P＜0.0001）:其中 12dpi 组 CD3-NK1.1+DX5+IFN-γ+ NK 细胞的比例与 12dpn组相比有所上调（P＜0.0001）,18dpi 组 CD3-NK1.1+DX5+IFN-γ+NK 细胞的比例与18dpn组相比有所上调（P＜0.01）,但18dpi组与12dpi组相比显著下调（P＜0.01）。结论:1.孕早期发生弓形虫感染后,母胎界面PD-1/PD-L1通路的表达水平呈先上升后下降的趋势,并且与主要的炎症因子IFN-γ呈正相关性表达,提示弓形虫感染后PD-1与IFN-γ的相互调节作用。2.孕早期发生弓形虫感染后,母体肝脏和母胎界面毒性相关的NK细胞的比例上调,且毒性亚型uNK细胞表面的PD-1/PD-L1因子与IFN-γ因子同步上调,提示PD-1可调控毒性亚型NK细胞的分化,从而参与妊娠期抗弓形虫感染的过程。