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硫酸软骨素(Chondrotin Sulfate,CHS)是动物机体中一种重要的酸性粘多糖。本文旨在建立从黄鳝(Monopterus albus)骨中分离纯化CHS的方法,并研究其降血脂作用。
第一部分,研究比较了几种从黄鳝骨中抽提出CHS的方法,确定了超声波辅助碱提一酶解的提取方法,通过正交实验建立了该方法的优化工艺:加入原料重12倍体积的提取液,超声波处理5min后在40℃恒温条件下,碱提6h后,再调节提取液pH为6.5,加入原料量2%的木瓜蛋白酶在40℃下酶解12h;并对酶解后几种去蛋白方法和不同乙醇用量沉淀多糖进行了对比,选定用三氯乙酸(TCA)除蛋白后再加入2.5倍乙醇沉淀多糖效果较好。在最佳提取工艺下得到CHS粗提物得率为4.53%,纯度达75.67%,蛋白含量为12.42%。
第二部分,采用离子交换层析法对粗提物进行了进一步纯化。先比较了5种离子交换剂对粗提液中CHS和杂蛋白的吸附效果,选定了用HD-8大孔阳离子交换树脂进行纯化;并研究了不同流速、不同上样量、不同pH值对纯化效果的影响,最后确定了用pH4.0 0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱,20mg/mL的多糖液上样后以20mL/h速度洗脱效果最好;离子交换树脂层析得到洗脱液经G-25层析脱盐后进行纯度鉴定,结果显示精制品含有硫酸基,CHS含量达92.31%,琼脂糖凝胶电泳实验也显示提取物呈现单一条带,且泳动速度与Sigma公司CHS-C标准品一致,红外吸收光谱法检测其特征与标准品极为相似,并与文献报道一致。
第三部分,将提取的CHS作用于小白鼠实验,检测其降血脂功能。购48只昆明种小鼠,体重18±3g,随机分为6组(空白对照组、高脂对照组、多糖低中高剂量组、阳性药物组),每组8只,空白对照组给普通饲料,其余各组灌胃给高脂乳剂,各多糖组腹腔注射不同浓度的多糖溶液,三周后取血清,测定血清甘油三酯(Triglycerides,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)和低密度脂蛋白(Low-density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)的水平,结果显示提取的CHS多糖具有明显的降血脂功能,较高脂模型组,多糖低中高剂量组均能显著降低血清TC,LDL-C水平,TG水平略有降低,但差异不显著,其中中剂量组效果最佳,明显优于血脂康药物组,为其进一步研究开发成药物提供了一定参考价值。