研究背景：中性粒细胞即多形核细胞（polymorphonuclear cells, PMNs）是机体承担固有免疫的主要细胞之一，构成了免疫防御机制的第一道防线。PMN防御系统中最重要的一个环节是通过呼吸氧爆发过程中产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)即ROS爆发，其细胞内抑菌杀菌作用与NADPH氧化酶介导产生ROS直接相关。目前有研究发现，机体抗结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染的过程中，PMN起着重要的免疫保护作用，有证据显示PMN吞噬Mtb后通过释放ROS达到杀死Mtb的目的，但其机制却不明确。探讨Mtb诱导PMN活性氧爆发机制，在抗结核感染的天然免疫作用，对于全面了解机体抗结核感染的免疫保护机制，具有重要的理论意义和临床应用价值。　　目的：建立流式细胞术检测人外周血PMN感染Mtb时ROS产生；观察不同的信号阻断剂对PMN感染Mtb时ROS产生的影响，了解所涉及信号通路。　　方法：　　1.取健康人外周血标本加入双氢罗丹明（DHR）或2′,7′二氯二氢荧光素二酯酸（DCFH-DA）37℃孵育15 min后，分别再加佛波醇酯（Phorbo12-myristate13-acetate, PMA）、Mtb、大肠埃希菌（Ecoli）混匀，置37℃水浴5～90 min，经溶血和洗涤后，PBS重悬，流式细胞术检测PMN内的罗丹明123(rhodamine123, RHO)或氧化型二氯荧光素(dichlorofluorecin, DCF)的荧光强度。　　2.取健康人外周血用Percoll分离获得PMN，加DHR或DCFH-DA37℃孵育15 min后，分别与PMA、Mtb、Ecoli混匀，置37℃水浴5～90 min，流式细胞术检测PMN内RHO或DCF的荧光强度。　　3.取健康人外周血和DHR37℃孵育15 min后，与PMA相混合，置37℃水浴5～90 min，溶血和洗涤，分别用磷酸盐缓冲液（PBS, pH7.2）、1％甲醛重悬、1%多聚甲醛（Paraformaldehyde,1%PFA）重悬，流式细胞术检测PMN内RHO的荧光强度。　　4.取健康人外周血预先分别加ERK1/2阻断剂U0126、MAPKp38阻断剂SB203580或PKC阻断剂GF109203x孵育30 min，再加DHR37℃孵育15 min，然后分别再加PMA、Mtb、Ecoli混匀，置37℃水浴。30 min对PMA刺激组进行溶血和洗涤，PBS重悬；60 min对Mtb、Ecoli刺激组进行溶血和洗涤，PBS重悬，流式细胞术检测PMN内RHO的荧光强度，并与对照组比较RHO的荧光强度变化情况。　　结果:　　1.以DHR为荧光探针时，全血标本或分离PMN经PMA刺激后产生ROS的时间动力学相似，在37℃作用5～60 min时ROS量呈递增趋势，且在60 min左右达到峰值，60～90 min时渐下降。分离PMN比刺激全血标本产生ROS峰值高。以DHR为荧光探针时，Mtb、Ecoli刺激全血或分离PMN产生ROS的时间动力学相似，在37℃作用5～90 min时ROS量呈递增趋势。　　2.以DCFH-DA为荧光探针时，PMA、Mtb、Ecoli刺激全血PMN产生ROS的时间动力学相似，在37℃作用5 min时ROS量达到峰值，随后出现明显递减趋势，而PMA刺激分离PMN产生ROS量在5～30 min时逐渐增高并在60～90 min时达平台期，Mtb、Ecoli刺激分离PMN产生ROS在5～90 min时逐渐增高。　　3.人外周血与PMA在37℃水浴作用不同时间段，与PBS重悬组比较，1%甲醛、1%PFA均可显著降低胞内RHO的荧光强度，两者之间的差别有统计学意义。　　4. ERK1/2阻断剂U0126、MAPKp38阻断剂SB203580和PKC阻断剂GF109203x均可降低PMA、Mtb、Ecoli刺激PMN的RHO荧光强度。　　结论：　　1.用流式细胞术检测PMN呼吸爆发时ROS产生，荧光探针DHR比DCFH-DA更稳定、敏感。　　2. DHR探针检测PMN呼吸爆发时ROS产生，全血标本与分离PMN标本的检测结果相似，但PMA刺激分离PMN的ROS峰值明显高于全血标本。DCFH探针检测Mtb、Ecoli刺激全血标本时，PMN产生ROS的动力学与PMA刺激时相似。　　3. Mtb刺激比Ecoli刺激PMN产生更多ROS，提示Mtb激活PMN产生更多的杀菌活性物质。　　4.含甲醛的试剂对PMN的ROS产生有明显降低作用。　　5.应用不信号通路阻断剂方法证明，Mtb、Ecoli激发PMN产生ROS过程与PMA激发时相似，均涉及ERK、MAPKp38和PKC途径。