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在以往的抗BYDV转基因小麦研究中,已经使用的策略有CP基因介导的病毒抗性、复制酶基因介导的病毒抗性、运动蛋白基因介导的抗性,虽然这些抗性手段对BYDV具有延迟发病的抗性作用,但一直没有获得能够达到高度抗性水平的抗BYDV转基因小麦植株。同时,这些抗性手段都具有专一性,只对基因来源病毒表现抗性,对其他病毒没有作用,即不具有广谱性。本文从进一步提高对BYDV的特异抗性和病毒广谱抗性两个方面入手进行小麦转基因研究,希望获得高抗BYDV的转基因小麦植株和具有广谱病毒抗性的转基因小麦。 在提高对BYDV抗性的转基因小麦研究方面,利用BYDV-GPV株系的复制酶基因(Pep)片段和外壳蛋白基因(CP)片段构建成可表达复合发夹RNA(hpRNA)——含有由Rep片段双链(CP双链)RNA构成的茎和反义CP(反义复制酶片断)RNA构成的环——的表达框架,将该框架分别连入含有CaMV 35S启动子和Emu启动子的真核表达载体,通过农杆菌介导法(转35S:CP+/Rep-/CP-结构)、基因枪法(转Emu:Rep+/CP-/Rep-结构)和花粉管通道法(分别转Emu:Rep+/CP-/Rep-和Emu:CP+/Rep-/CP-结构)对小麦进行遗传转化,基于该结构表达的hpRNA诱发植物体内针对病毒基因组不同部位的RNA干扰机制而达到特异性高度抗病毒的目的。实验结果表明:①在农杆菌介导法获得的82株G418抗性植株中有75株PCR结果呈阳性;经过第一次病毒抗性试验,有59株未发病或只有轻微症状:Dot blot检测表明59株抗性植株中有46株整合有外源基因;ELISA结果表明整合有外源基因的植株中有37株能够正常表达外源基因;Southernblot结果表明外源基因在小麦体内多以双拷贝形式存在:第二次病毒抗性试验表明,在Dot blot、ELISA呈阳性的37株再生植株中有14株表现低度抗性,有12株表现中度抗性,有10株表现高度抗性,另外1株在实验过程中死亡。②在基因枪法转化中,因未使用标记基因,故应用改进的叶片快速PCR对再生幼苗在生根阶段进行筛选,共移栽成活64株快速PCR阳性植株;经第一次病毒抗性试验有30株表现抗性,Dot blot结果表明其中21株整合有外源基因:经第二次病毒抗性试验,21株Dot blot阳性植株中有5株表现低度抗性,有8株表现中度抗性,有8株表现高度抗性。③通过花粉管通道法获得转Emu:Rep+/CP-/Rep-结构的种子367粒,获得转Emu:CP+/Rep-/CP-结构的种子545粒:对T1代幼苗进行大田抗病性鉴定结果表明,有2株转Emu:CP+/Rep-/CP-结构小麦植株在接毒40天后仍没有明显发病症状。 在提高病毒抗性谱方面,利用克隆自粟酒酵母的pac1基因通过农杆菌介导法转化小麦。该基因是一种RNA双链分解酶。由于大多数植物病毒为RNA病毒,不管其基因组是单链还是双链,在寄主体内复制过程都会有一个双链RNA中间体阶段,如果通过基因工程手段将pac1基因转入植物体,利用其降解病毒dsRNA的活性而阻断病毒复制过程,就有可能达到抗植物病毒病的目的。并且pac1的作用靶位点只针对RNA双链,对RNA的序列无特殊要求,这就扩大了其对病毒抗性谱。本转化试验共获得41株G418抗性植株;经第一次病毒抗性试验获得30株抗性植株:其中27株PCR和Dot blot结果呈阳性:ELISA和RT-PCR结果表明27株整合有外源基因的再生植株中有25株能够正常表达外源基因;经第二次病毒抗性试验,获得12株低度抗性植株,12