【摘 要】
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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中的强毒株引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。鸡和多种禽类感染后可导致较高发病率和死亡率,对全球的家禽养殖业造成严重的经济损失。我国将其作为一类疫病列入国家中长期动物疫病防治规划当中。两广地区家禽和水禽养殖业发达,禽肉类食品的市场需求量大,活禽交易市场多,且位于我国南部,气
【基金项目】
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国家重点研发计划（2016YFD0501603）； 国家重点研发计划（2018YFD0500100）； 国家自然科学基金（3187130385）； 广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项（2019KJ119）； 2018年省级现代农业科技创新联盟建设项目（20
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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中的强毒株引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。鸡和多种禽类感染后可导致较高发病率和死亡率,对全球的家禽养殖业造成严重的经济损失。我国将其作为一类疫病列入国家中长期动物疫病防治规划当中。两广地区家禽和水禽养殖业发达,禽肉类食品的市场需求量大,活禽交易市场多,且位于我国南部,气候湿润,植被种类丰富,有多条候鸟迁徙路线,在此多因素背景的存在下,无疑为NDV创造了更加有利的传播条件。因此,本研究在2017～2019年期间,进行了广东省NDV的流行病学调查及两广地区健康禽群和环境中NDV的监测工作。在流行病学调查中,用常规的病毒分离鉴定的方法共分离出4株NDVs,均为ClassⅡNDV,其中2株为基因Ⅸ型NDVs,2株为基因Ⅱ型,总的阳性分离率为0.19%。调查统计结果显示,从宿主分布看,NDV在水禽中的阳性分离率较高（0.83%）,其次为家禽（0.31%）;从来源分布看,NDV在动物园中的阳性分离率为最高（1.16%）,其次为家禽养殖场（0.26%）。在对两广地区健康禽群及环境中NDV的监测过程中,鉴定出80株NDVs,其中ClassⅠ-1b亚型77株,占阳性分离样品的96.25%,阳性分离率为5.02%;3株ClassⅡ基因Ⅱ型NDVs,占阳性分离样品的3.75%,阳性分离率为0.20%。以上的调查及监测结果表明,当前ClassⅠNDV较广泛地存在于活禽交易市场和家禽养殖场中,ClassⅡNDV的阳性分离率较低,但仍然存在,且宿主分布较广,而常规的病毒分离鉴定的方法费时、费力,灵敏性相对较差,且难以进行高通量检测。基于此,本研究通过多序列比对分析,根据ClassⅠ和ClassⅡNDV的P基因阅读框的碱基数差异,在其上下游相对保守区域设计了一对用于检测的扩增引物NDV P1-F和NDV P1-R,首次利用HRM分析技术成功建立了区分ClassⅠ和ClassⅡNDV的高分辨率熔解曲线的检测方法（PCR-HRM）。该方法兼具特异性强、灵敏度高和稳定性好等优点,其对非NDV的多种禽类病毒均无阳性扩增结果,最低检测线可达22.5copies/μL（ClassⅠ）和26.2 copies/μL（ClassⅡ）,且样品熔解温度的批内差异在0.00℃～0.13℃之间,批间差异在0.03℃～0.28℃之间。使用此方法进行检测时,可实现从PCR扩增到HRM结果判定的全程闭管操作,相比于常规核酸电泳大大降低了交叉污染的风险,且耗时短、操作简便,可同时进行384个样品的检测,根据ClassⅠ和ClassⅡNDV的熔解温度区间即可对临床样品进行鉴别。综上所述,本研究通过对广东省NDV流行病学调查和两广地区健康禽群及环境中NDV的监测,了解了当前存在于养殖场、活禽市场及野鸟中NDV的流行情况,进而建立了区分ClassⅠ和ClassⅡNDV的高分辨率熔解曲线的检测方法,为快速鉴别临床样品中两类NDV提供了检测手段。
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