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【目的】
通过过表达促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)，并建立小鼠脓毒症急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)模型，观察过表达TPO对脓毒症小鼠急性肺损伤和肺泡细胞自噬水平的影响，探讨过表达TPO在脓毒症急性肺损伤中的保护作用及其机制。
【方法】
本研究选择36只雄性健康SPF级C57/BL6小鼠并构建质粒。随机将36只小鼠分为三组，分别为正常组、空载组和TPO组。每组分为转染后1天和5天两个时间点，每个时间点各6只小鼠。转染24小时后收集样本，通过荧光显微镜，观察小鼠肝脏切片，对质粒上携带GFP基因表达的绿色荧光含量进行比较，因此来判定质粒转染效率。转染后第5天收集小鼠外周血，检测血小板数量以验证TPO质粒的表达效率。
将转染空载质粒的12只小鼠和转染TPO的6只小鼠分为三组：(1)空载+假手术组(2)空载+CLP组；(3)TPO+CLP组。动态观察小鼠术后一般情况变化，CLP术后24小时分别搜集三组小鼠血液、肺组织，肺泡灌洗液，检测全血血小板计数，取肺组织测湿干比(W/D)，通过H-E染色检测肺组织损伤程度，ELISA法分别检测血浆及肺泡灌洗液中炎症细胞因子水平变化，Westernblot检测肺泡细胞自噬相关蛋白(LC3II/I、P62)水平的变化，通过透射电镜检测肺组织细胞自噬体的变化，免疫荧光技术检测LC3定位和表达水平变化。
【结果】
1.TPO转染效率的评估：因质粒中带有GFP基因，转染24小时后，通过荧光显微镜观察小鼠肝脏切片，在空载组和TPO组均可见大量绿色荧光，而正
常组未见绿色荧光；此外，转染5天后，在血常规中空载组与正常组比，血小板计数差异无统计学意义(P＞0.05)；TPO组与空载组比，血小板数量明显升高(P＜0.0001)。
2.CLP术后各组小鼠血小板计数的变化：CLP术后24小时，空载+CLP组与空载+假手术组相比，血小板计数明显下降(P＜0.001)；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，血小板计数明显上升(P＜0.01)。
3.各组小鼠术后血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平变化：通过ELISA检测，CLP术后24小时，空载+CLP组与比空载+假手术组比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显升高(P＜0.001)；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显降低(P＜0.001)。
4.各组小鼠术后肺泡灌洗液(BALF)炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平变化：通过ELISA检测，CLP术后24小时，空载+CLP组与比空载+假手术组比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显升高(P＜0.001)；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显降低
(P＜0.001)。
5.肺组织病理切片结果：空载+假手术组小鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡壁与间质内无炎性细胞浸润；空载+CLP组小鼠肺泡结构完全破坏，部分肺泡断裂、融合，肺泡腔内有渗出液。肺泡内见大量炎性细胞浸润及不等量红细胞渗出；TPO+CLP组大鼠肺泡结构部分破坏，断裂。可见少量炎症细胞浸润，但相对于空载+CLP组，肺泡损伤程度更小。
6.肺组织W/D值结果：空载+CLP组与空载+假手术组相比，肺组织W/D值有明显差异(P＜0.05)。TPO+CLP组与空载+CLP组相比，肺组织W/D值有明显差异(P＜0.05)。
7.肺组织Westernblot检测自噬水平变化：通过Westernblot检测，与空载+假手术组相比，空载+CLP组肺组织LC3II/I含量增加(P＜0.05)，P62含量减少(P＜0.001)；与空载+CLP组相比，TPO+CLP组肺组织LC3II/I含量减少(P＜0.01)，P62含量增多(P＜0.01)。
8.肺组织免疫荧光染色检测LC3变化：LC3阳性信号主要在细胞浆着色，呈点状或斑片状。空载+CLP组与空载+假手术组相比，LC3阳性信号表达增加；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，LC3阳性信号表达减少。
9.肺组织透射电镜：空载+CLP组与空载+假手术组相比，可见肺泡上皮细胞自噬体明显增多，而TPO+CLP组较空载+CLP组相比，肺泡上皮细胞自噬体减少。
【结论】
1.外源TPO基因可转染到小鼠体内，在肝脏高表达，并可提高小鼠血小板数量。
2.过表达TPO可改善脓毒症导致的血小板数量下降，对脓毒症导致的ALI起保护作用。
3.过表达TPO通过抑制细胞自噬减轻脓毒症引起的ALI。
通过过表达促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)，并建立小鼠脓毒症急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)模型，观察过表达TPO对脓毒症小鼠急性肺损伤和肺泡细胞自噬水平的影响，探讨过表达TPO在脓毒症急性肺损伤中的保护作用及其机制。
【方法】
本研究选择36只雄性健康SPF级C57/BL6小鼠并构建质粒。随机将36只小鼠分为三组，分别为正常组、空载组和TPO组。每组分为转染后1天和5天两个时间点，每个时间点各6只小鼠。转染24小时后收集样本，通过荧光显微镜，观察小鼠肝脏切片，对质粒上携带GFP基因表达的绿色荧光含量进行比较，因此来判定质粒转染效率。转染后第5天收集小鼠外周血，检测血小板数量以验证TPO质粒的表达效率。
将转染空载质粒的12只小鼠和转染TPO的6只小鼠分为三组：(1)空载+假手术组(2)空载+CLP组；(3)TPO+CLP组。动态观察小鼠术后一般情况变化，CLP术后24小时分别搜集三组小鼠血液、肺组织，肺泡灌洗液，检测全血血小板计数，取肺组织测湿干比(W/D)，通过H-E染色检测肺组织损伤程度，ELISA法分别检测血浆及肺泡灌洗液中炎症细胞因子水平变化，Westernblot检测肺泡细胞自噬相关蛋白(LC3II/I、P62)水平的变化，通过透射电镜检测肺组织细胞自噬体的变化，免疫荧光技术检测LC3定位和表达水平变化。
【结果】
1.TPO转染效率的评估：因质粒中带有GFP基因，转染24小时后，通过荧光显微镜观察小鼠肝脏切片，在空载组和TPO组均可见大量绿色荧光，而正
常组未见绿色荧光；此外，转染5天后，在血常规中空载组与正常组比，血小板计数差异无统计学意义(P＞0.05)；TPO组与空载组比，血小板数量明显升高(P＜0.0001)。
2.CLP术后各组小鼠血小板计数的变化：CLP术后24小时，空载+CLP组与空载+假手术组相比，血小板计数明显下降(P＜0.001)；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，血小板计数明显上升(P＜0.01)。
3.各组小鼠术后血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平变化：通过ELISA检测，CLP术后24小时，空载+CLP组与比空载+假手术组比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显升高(P＜0.001)；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显降低(P＜0.001)。
4.各组小鼠术后肺泡灌洗液(BALF)炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平变化：通过ELISA检测，CLP术后24小时，空载+CLP组与比空载+假手术组比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显升高(P＜0.001)；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，血浆炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6水平明显降低
(P＜0.001)。
5.肺组织病理切片结果：空载+假手术组小鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡壁与间质内无炎性细胞浸润；空载+CLP组小鼠肺泡结构完全破坏，部分肺泡断裂、融合，肺泡腔内有渗出液。肺泡内见大量炎性细胞浸润及不等量红细胞渗出；TPO+CLP组大鼠肺泡结构部分破坏，断裂。可见少量炎症细胞浸润，但相对于空载+CLP组，肺泡损伤程度更小。
6.肺组织W/D值结果：空载+CLP组与空载+假手术组相比，肺组织W/D值有明显差异(P＜0.05)。TPO+CLP组与空载+CLP组相比，肺组织W/D值有明显差异(P＜0.05)。
7.肺组织Westernblot检测自噬水平变化：通过Westernblot检测，与空载+假手术组相比，空载+CLP组肺组织LC3II/I含量增加(P＜0.05)，P62含量减少(P＜0.001)；与空载+CLP组相比，TPO+CLP组肺组织LC3II/I含量减少(P＜0.01)，P62含量增多(P＜0.01)。
8.肺组织免疫荧光染色检测LC3变化：LC3阳性信号主要在细胞浆着色，呈点状或斑片状。空载+CLP组与空载+假手术组相比，LC3阳性信号表达增加；TPO+CLP组与空载+CLP组相比，LC3阳性信号表达减少。
9.肺组织透射电镜：空载+CLP组与空载+假手术组相比，可见肺泡上皮细胞自噬体明显增多，而TPO+CLP组较空载+CLP组相比，肺泡上皮细胞自噬体减少。
【结论】
1.外源TPO基因可转染到小鼠体内，在肝脏高表达，并可提高小鼠血小板数量。
2.过表达TPO可改善脓毒症导致的血小板数量下降，对脓毒症导致的ALI起保护作用。
3.过表达TPO通过抑制细胞自噬减轻脓毒症引起的ALI。