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第一部分细胞外信号调节激酶1/2和周期蛋白E1在香烟烟雾暴露致大鼠肺血管重塑中的表达变化目的：探讨香烟烟雾暴露大鼠肺血管中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和周期蛋白E1(cyclinE1)的表达变化以及它们与香烟烟雾暴露致大鼠肺血管重塑程度的关系。方法：24只成年雄性Wistar大鼠随机分为四组：C组(对照组),S-1M(烟雾暴露1月组),S-3M(烟雾暴露3月组)和S-6M(烟雾暴露6月组)。HE染色观察肺血管壁增厚情况,平滑肌细胞α肌动蛋白(α-SMA)染色观察肺小血管肌化程度。免疫组织化学染色观察ERK1/2和cyclinE1在大鼠肺动脉平滑肌中的定位表达,Western blotting法检测大鼠肺动脉平滑肌中ERK1/2和cyclinE1的蛋白表达量。结果：随烟雾暴露时间的延长,完全肌化血管比例、肺血管壁厚度与血管直径的比值(WT)、ERK1/2和cyclinE1的蛋白表达随烟雾暴露时间延长而显著增加。ERK1/2与cyclinE1表达与大鼠肺WT值以及完全肌化血管比例成显著正相关,ERK1/2与cyclinE1的表达量之间也成显著正相关关系。结论：香烟烟雾暴露可以导致大鼠肺血管重塑。同时,活化的ERK1/2和cyclinE1在香烟烟雾暴露大鼠肺血管中的表达显著增加且与烟雾暴露时间成正相关,提示提示活化的ERK1/2和cyclinE1可能与香烟烟雾暴露所致的大鼠肺血管重塑有关。第二部分细胞外信号调节激酶1/2和周期蛋白E1在香烟烟雾提取物致大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用以及二者的关系目的：探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)是否通过上调周期蛋白E1(cyclinE1)的表达进而参与调节香烟烟雾提取物(CSE)刺激培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(rPASMCs)的异常增殖。方法：进行大鼠肺动脉平滑肌细胞的原代培养,根据本实验室以往研究结果,选择对细胞的增殖促进作用最强的2%CSE进行实验。为验证cyclinE1在CSE导致的rPASMCs增殖中的作用,将细胞分为4组：control组,2%CSE组,NCsiRNA组,CE1siRNA组。为探索ERK1/2在CSE导致的rPASMCs增殖中的作用及其对cyclinE1的调控作用,再将细胞分为另外4组：control组,2%CSE组,PD98059组,2%CSE+PD98059组。各组细胞同步化后给予2%CSE和干预药物进行共培养。使用台盼蓝染色直接细胞计数法和BrdU掺入法检测细胞增殖情况。Western blotting和免疫荧光染色检测ERK1/2和cyclinE1的蛋白表达水平。流式细胞术检测细胞周期分布。结果：2%CSE能上调cyclinEl和磷酸化ERK1/2的表达,并进而引起rPASMCs异常增殖。cyclinE1siRNA可以抑制2%CSE对cyclinEl的上调作用,从而抑制rPASMCs的异常增殖。PD98059可以抑制2%CSE对ERK1/2的磷酸化作用和对cyclinE1的上调作用,并可以导致细胞G1期停滞和部分抑制rPASMCs的异常增殖。结论：活化的ERK1/2在CSE诱导的rPASMCs异常增殖中发挥重要作用,其部分原因可能是通过上调cyclinE1的表达。第三部分细胞外信号调节激酶1/2的小干扰RNA能够通过下调cyclinE1的表达而减轻香烟烟雾暴露大鼠肺血管重塑的程度目的：探讨ERK1/2-cyclinE1信号通路在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重塑中的作用。方法：构建ERK1和ERK2的siRNA,分别转染至体外培养的rPASMCs内和气管注射入大鼠肺血管内,以降低rPASMCs和大鼠肺血管中的ERKl/2的表达。rPASMCs以CSE刺激培养,大鼠则暴露于香烟烟雾或者空气中12周。使用台盼蓝染色直接细胞计数法和BrdU掺入法检测细胞增殖情况。实时定量RT-PCR检测ERK1/2和cyclinE1的mRNA表达水平。Western blotting和免疫组织化学染色检测ERK1/2和cyclinEl的蛋白表达水平。流式细胞术检测细胞周期的分布。HE染色和平滑肌细胞a-SMA染色观察肺血管重塑情况。结果:ERKl/2siRNA有效抑制了CSE刺激培养的rPASMCs中ERK1/2和cyclinE1的mRNA和蛋白表达,造成细胞G1期停滞,部分抑制细胞增殖。而在大鼠体内,ERK1/2siRNA降低了香烟烟雾暴露大鼠肺血管中ERK1/2和cyclinE1的mRNA和蛋白表达,减轻了大鼠肺血管重塑程度。结论：ERK1/2-cyclinEl信号通路在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重塑中具有重要作用,ERK1/2siRNA可以通过下调cyclinE1表达而改善大鼠肺血管重塑程度。