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[目的]甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎,是由甲型肝炎(HepatitisAvirus)感染人体引起的一种以肝脏损伤为主的急性传染病。临床表现为恶心、腹泻、皮肤发黄、发烧和腹痛。其发病季节带有地区性特征,流行具有周期性,与国家或地区的发达程度包括经济、卫生水平有关,甲肝已成为世界卫生的重点关注问题。预防甲肝可使用甲肝减毒活疫苗或灭活疫苗,二者相比,甲肝灭活疫苗具有更强的免疫原性,免疫后能诱发高水平的体液免疫,无病毒返祖,疫苗稳定性好,易于保存、运输和使用。目前国内批准生产的灭活疫苗均是采用人二倍体细胞(KMB17和2BS细胞株制备的),因体制原因两株细胞仅能在少数单位使用,鉴于此云南沃森生物技术股份有限公司(下称“沃森生物”)自己建立了一株背景来源清晰、质量检测合格的新的人胚胎二倍体细胞Walvax-2,该细胞系无外源因子污染,各代次细胞检测指标符合《中华人民共和国药典2015版三部》规定。沃森生物原有甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)产品,由于Vero细胞基质制备的疫苗存在潜在致瘤性的风险,公司拟将疫苗制备的细胞基质替换成人二倍体细胞Walvax-2,对产品进行升级换代。本研究旨在筛选建立甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上的适应株,并根据新药研发政策和《中华人民共和国药典2015版三部》对适应株的质量标准与遗传稳定性进行研究[1],为后期使用Walvax-2细胞进行甲肝灭活疫苗的制备提供依据。[方法]将甲肝毒株YN5适应到Walvax-2细胞上并于35℃连续培养,对适应株的工作种子批(第29代)进行鉴别实验、病毒滴定、无菌检查和支原体检查这四项检定;再取其中5个代次(第24、27、29、35和40代)进行RNA提取、RT-PCR特异扩增等步骤,最后采用生物信息学软件DNAMAN、Vector NTI、BioEdit等进行序列分析,从而判断Walvax-2细胞作为一株新的人源二倍体细胞株用于甲肝灭活疫苗开发的可行性。[结果]甲型肝炎病毒毒种YN5株的工作种子批经检定,并报送中国食品药品检定研究院检验,结果表明鉴别实验、无菌检查和支原体检查均符合规定,病毒滴度为7.67lgCCID50/ml;适应株5个代次全基因之间核苷酸序列同源性为100%,它们与标准株HM175全基因组核苷酸序列同源性均为99.4%;P24在5’-NCR(101-200bp)发生部分变异,表现为124位和152位发生突变、134～137bp缺失,之后该突变稳定遗传;5个代次病毒在2A(3012～3210bp)区段发生2处突变;所有代次的毒株与野毒株HM175为同一基因型,即IB型;5个代次病毒的主要抗原位点与HM175完全一致。[结论]经检定,甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上适应培养获得的工作种子批符合企业质检规程和《中华人民共和国药典2015版三部》相关要求,说明Walvax-2细胞不仅可以满足公司甲肝疫苗品种的细胞替换要求,而且有潜力作为其他病毒疫苗研发和生产用细胞基质;通过研究甲型肝炎病毒YN5株在Walvax-2细胞连续传代后的遗传特性,发现Walvax-2细胞安全性良好,可以很好的替代Vero细胞,为以Walvax-2细胞为细胞基质,制备甲肝灭活疫苗提供了新药申报的数据支持。