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肺癌的发生及死亡率居各类恶性肿瘤的首位。由于肺癌不易早期发现及治疗的高难度,因此,预防肺癌的发生,对降低肺癌发生率及死亡率具有举足轻重的作用。中医的“治未病”预防疾病思想与现代医学中的化学预防异曲同工,其目的均是用药物减少肺癌的发生率。夏枯草Prunella vulgarisL.为唇形科植物,性苦寒,具清热解毒之功效,其成分主要包括三萜类、酚酸类、黄酮类、多糖等成分,具有确切的防治肺癌疗效,在临床上广泛使用。Nrf2/ARE信号通路是干预癌症发生的重要信号通路,它对细胞抵御外源有害物质以及氧化应激有着重要作用。本课题研究以中医药治未病思想为指导,以夏枯草为模型药物,引进、消化再创新,通过Nrf2信号通路,从整体动物水平、细胞水平、分子蛋白水平,研究夏枯草防治肺癌的物质基础及其作用机制。主要内容：1.三萜类组分的富集分离提取不同批次的夏枯草三萜,然后利用大孔树脂得到三萜类成分,建立人肺腺癌细胞A549、SPC-A-1体外药效筛选体系,对夏枯草进行了活性筛选评价,结果显示江苏产夏枯草得到的三萜对肺癌细胞的抑制作用最好,对A549、SPC-A-1的IC50分别为278.17.356.73μg/mL。2.夏枯草三萜化学预防肺癌的模型建立①人肺癌细胞模型的建立：建立肺癌细胞A549及SPC-A-1细胞模型,采用MTT法,以细胞增殖抑制率为指标,评价夏枯草三萜抗肺癌的效果,结果显示夏枯草三萜类对A549及SPC-A-1的IC50分别为278.17,356.73μg/mL。说明夏枯草对肺癌细胞具有较强抑制作用,其中A549细胞对夏枯草更为敏感。结果表明所建立的细胞模型能有效地应用于活性筛选。②人正常支气管上皮细胞模型的建立：建立人正常支气管上皮细胞Normal Human bronchial epithelial cells(NHBE)的体外药效筛选体系,采用MTT法,以细胞增殖抑制率为指标,评价夏枯草三萜抗肺癌的效果,结果显示夏枯草三萜类对NHBE的IC50为509.82μg/mL,说明夏枯草对正常细胞的抑制作用较肺癌细胞小。建立的生物化学预筛体系能有效筛出潜在的防治药物。③香烟烟雾提取物诱导的NHBE细胞模型建立：建立香烟烟雾提取物诱导的NHBE细胞模型,实验结果表明,NHBE细胞在10%香烟烟雾提取物处理24h后,其抑制率为30.12±2.7%,而同时加入50、100、200、400μg/mL的夏枯草后,抑制率为26.67±1.4%、22.47±2.2%、19.39±2.3%、21.19±2.5%；CSE对NHBE有毒害作用,随浓度增加而增大。结果表明所建立的模型能反映夏枯草减少诱导物的损伤。④整体动物模型的建立：建立了KM小鼠模型,实验结果表明,夏枯草可以显著提高KM小鼠体内Ⅱ相解毒酶GST、NQO1活力与GSH含量,用5g生药/kg/d与10g生药/kg/d浓度连续灌胃一周,夏枯草低剂量组的KM小鼠体内NQO1、GST酶活力及GSH含量分别为空白对照组的1.20±0.23倍、1.75±0.37倍、5.67±0.45倍,夏枯草高剂量组的KM小鼠体内NQO1、GST酶活力及GSH含量分别为空白对照组的1.38±0.37倍、2.42±0.26倍、11.13±0.33倍；建立裸鼠模型,实验结果表明,夏枯草可以显著降低裸鼠的瘤大小,抑瘤率：夏枯草高剂量组89%,夏枯草低剂量组68%；建立A/J小鼠模型,结果表明,夏枯草可以显著降低A/J小鼠肺部肿瘤数,提高A/J小鼠的脾脏指数,与对照组比均有显著性差异(p<0.05)。结果表明所建立的整体动物模型能客观地反映夏枯草预防肺癌的活性。3.夏枯草三萜类化学预防肺癌的机制研究①夏枯草对NHBE细胞中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：在50、100、200、400μg/mL的夏枯草生药浓度下,NHBE细胞内GST酶活力分别为100.21±5.11%、125.38±4.42%、136.48±3.96%、156.19±4.88%,NQO1酶活力分别为100.72±6.13%、113.25±4.92%、139.53±5.35%、146.81±4.27%,GSH含量分别103.37±4.86%、110.52±5.13%、125.94±5.87%、133.68±5.26%,与CSE组比均有显著性差异(p<0.05)。westernblot显示夏枯草可以显著提高A549细胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表达。结果表明夏枯草可以提高肺正常细胞NHBE中的Ⅱ相解毒酶活力及表达,提高对外界刺激的抵御。②siRNA研究Nrf2信号通路在夏枯草三萜保护细胞中作用：成功建立Nrf2沉默的NHBE细胞,在正常条件下,GSTPI与NQO1蛋白表达均有明显降低,加入CSE未能引起GSTPI与NQO1的过表达,同时加入夏枯草三萜也未能有明显的细胞保护作用,表明夏枯草三萜是通过Nrf2信号通路起保护细胞作用。③夏枯草对香烟烟雾提取物细胞模型中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：NHBE细胞在10%CSE处理24h后,GSH含量降低为对照组的35.65±6.33%,GST活力升高为对照组的1.75±0.042倍,NQO1活力升高为对照组的2.14±0.037倍,加入125μg/mL的夏枯草后,GSH含量提高到对照组72.61±5.29%,GST活力降低到对照组1.44±0.059倍,NQO1活力降低到对照组1.5±0.049倍,与CSE组比均有显著性差异(p<0.05)。④熊果酸对香烟烟雾提取物细胞模型中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：在10%CSE与25μmol/L浓度熊果酸共同作用下,细胞内GSH含量为空白对照组的68.53±5.33%,GST活力为空白对照组的1.32±0.036倍,NQO1活力为空白对照组的1.55±0.058倍,与CSE组比均有显著性差异(p<0.05),且可以减少CSE引起的细胞DNA损伤,westernblot显示熊果酸可以显著提高A549细胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表达。结果表明熊果酸是夏枯草三萜中有效成分之一。4.夏枯草三萜类对肺癌细胞中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：在50、100、200、400μg/mL的夏枯草生药浓度下,A549中NQO1酶活力分别为73.21±6.33%、79.34±7.86%、72.38±5.55%、61.92±4.28%,GSH含量分别为57.44±4.86%、27.23±5.92%、21.76±5.03%、18.40±4.22%,SPC-A-1细胞中NQO1酶活力分别为91.09±5.34%、96.42±3.79%、74.57±4.39%、65.78±5.18%,GSH含量分别为52.53±3.18%、25.24±4.82%、20.19±4.76%、17.32±3.92%,与对照组比均有显著性差异(p<0.05),westernblot显示夏枯草可以显著降低A549细胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表达。夏枯草可以降低肺癌细胞A549中的Ⅱ相解毒酶活力及表达,降低对外界刺激的抵御。结论：不同产地、不同品种夏枯草属药材其内在的药效物质基础存在本质区别。夏枯草三萜对正常细胞的抑制率较肺癌细胞低。10%CSE作用24h情况下,NHBE细胞抑制率约为30%,而加入125μg/mL夏枯草三萜会使抑制率降低至80%,说明夏枯草具有细胞保护作用。夏枯草三萜可以显著减少苯并芘诱导的A/J小鼠中肺部肿瘤数,在裸鼠模型中,夏枯草三萜可抑制肿瘤发展,夏枯草三萜在KM小鼠内可以刺激Ⅱ相解毒酶的活力。在肺癌细胞A549与SPC-A-1中,夏枯草可降低Nrf2表达,GSTPI和NQO1表达及活力,GSH含量,且呈现出量效关系,而在NHBE细胞中则反之。熊果酸可以保护CSE作用的NHBE细胞,恢复由CSE引起的细胞内指标的改变,减少细胞DNA损伤,可能是夏枯草具有细胞保护作用的原因之一。