茯砖茶中的可培养微生物对儿茶素EGCG的生物转化

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茯砖茶是一种独特的微生物发酵茶。其加工过程中涉及微生物发酵的两步主要工序分别是渥堆和发花,其中发花是茯砖茶品质形成的关键工序,所以研究该过程的微生物种类及这些微生物对茶成分的转化作用对于解释茯砖茶的品质形成机制就显得尤为重要。本研究选取茯砖茶的匀堆、渥堆过程茶样、发花初始样、发花过程的第一天和第七天的茶样,以及茯砖茶成品,通过划线分离法尽可能多的从中分离出细菌和真菌菌株,并依靠形态学特征和分子生物学技术鉴定这些菌种,再将这些微生物分别接种在独创的富含表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、茶氨酸和咖啡碱的新型固态发酵系统中。经过一定时间的培养后,使用有机试剂分别提取各个微生物在此培养系统中生成的代谢产物,使用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨串联质谱进行检测,所得相关数据使用基于特征物的全范围质谱分子网络(FBMN)进行了全面而深入的分析,以阐述细菌和真菌在该发酵系统中代谢物的差异性及其对EGCG的生物转化。本论文取得了如下结果:首先,从茯砖茶中分离得到29株细菌和23株真菌。经鉴定,发现其中的细菌在分类学上可归为3个门、3个纲、3个目、5个科和5个属。在门水平上,细菌中属于厚壁菌门的菌株最多,约占总细菌菌株的90%(26株)。在属水平上将这些细菌归类为芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属和微杆菌属,其中芽孢杆菌属居多,约占总细菌菌株数的86%(25株)。本研究分离并鉴定的真菌则注释为3个门、5个纲、5个目、7个科和8个属。它们在属水平上主要包括散囊菌属、曲霉属、青霉属、枝孢霉属、烟管菌属、假丝酵母属、Cyberlindnera spp.、栓菌属和根毛霉属。实验分离的真菌大多数(18株)属于子囊菌门,其中包括茯砖茶的优势菌冠突散囊菌。其次,相关的液质数据证明细菌和真菌对EGCG的生物转化既有一些相同点,也存在显著性差异。其相同点为这些微生物均有水解没食子酸酯以及对EGCG的代谢、或生物转化能力;其差异表现在转化能力与结构修饰特性等方面。其中,真菌对EGCG的生物转化能力强于细菌。真菌修饰EGCG的产物主要为茯砖素A、茯砖素D与teasperin;而细菌代谢EGCG的产物主要是xanthocerin和茯砖素B。此外,虽然发现很多经真菌代谢的培养基样品中黄烷生物碱的质谱信号强度很高,但在未接种微生物的对照组培养基样品中,也能明显看到这类黄烷生物碱类化合物的质谱信号,因此本研究认为N-乙基吡咯烷酮取代的黄烷醇衍生物是由EGCG和茶氨酸经过一种有机化学反应生成,而不需要经过微生物的酶促反应生成。微生物发酵是包括茯砖茶在内的所有黑茶的特有风味和功效的驱动力。其对茶叶中原生化合物、尤其是关键风味物质EGCG的修饰很可能与黑茶的独特风味与功效相关。本论文对茯砖茶中的微生物的分离与鉴定,以及对这些微生物对EGCG的生物转化的研究,确定了EGCG是N-乙基吡咯烷酮取代的黄烷-3-醇A环衍生物和黄烷-3-醇B环裂环衍生物的底物来源,其中的A环衍生物的转化动力是自发的有机化学反应,而部分B环衍生物的转化动力主要是微生物。
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