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1 目标1.1 观察三草降压汤(SCD)以及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对HK-2细胞的毒性,建立HK-2细胞高血压肾损伤体外模型1.2 观察三草降压汤对AngⅡ诱导的HK-2细胞氧化应激的影响1.3 观察三草降压汤对AngⅡ诱导损伤后HK-2细胞TLR4/NF-κB/NLRP3炎症通路的影响2 方法高血压肾病体外模型的建立:首先将HK-2细胞以1X104每孔的浓度种植在96孔板中,将AngⅡ溶解在培养基中,制作成对应浓度的含药培养基,将细胞随机分为三组,每组六个复孔,分为空白组和加药组,四个加药组中各自加入浓度为0.1 μM、1μM、10 μM以及100μM的AngⅡ,培养箱内培养24小时后,细胞增殖与毒性检测试剂盒(cck-8法)检测细胞存活率;将SCD水提剂用培养基稀释,分为空白组和加药组,九个加药组中分别加入浓度为100 μg/ml、300 μg/ml、500μg/ml、800 μg/ml、1 mg/ml、3 mg/ml、5 mg/ml、8 mg/ml、10 mg/ml 的含 SCD培养基,培养箱培养24小时后,cck-8法检测细胞存活率。将HK-2细胞分为空白组和加药组,三个加药组中各自加入1 μM、10 μM和100 μM浓度的含AngⅡ培养基,每组三个复孔,培养24小时后Western Blot法检测细胞中TLR4及NF-κB p65的蛋白相对表达量观察SCD对AngⅡ诱导的HK-2细胞氧化应激损伤的影响,将HK-2细胞分为空白组、模型组(AngⅡ组)、AngⅡ+2mg/ml SCD 组、AngⅡ+4mg/ml SCD 组、AngⅡ+8 mg/ml SCD组、卡托普利组,培养12小时后,收集细胞,活性氧荧光探针法检测细胞内ROS表达量,WST-8法检测细胞内SOD抑制率,TBA法检测细胞内MDA表达量,培养24小时后检测HK-2细胞中ROS表达量。观察SCD对AngⅡ诱导的HK-2细胞炎症损伤的影响,将HK-2细胞分为空白组、AngⅡ组、AngⅡ+2 mg/ml SCD 组、AngⅡ+4 mg/ml SCD 组、AngⅡ+8 mg/ml SCD组、卡托普利组,培养24小时后,收集细胞WB法检测细胞内TLR4、NF-κB p65、MYD88、BCL2、BAX、NLRP3、Caspase-1 蛋白的相对表达量。3 结果高血压肾病体外模型的建立:cck-8结果证明,在检测剂量下各组细胞存活率的差异无统计学意义(p>0.05)。WB实验证明,1μMAngⅡ组中TLR4和NF-κB p65的表达量与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05),而10 μMAngⅡ组与100 μM AngⅡ组中TLR4和NF-κB p65的表达量与空白组相比升高,差异有统计学意义(p<0.05),10 μM AngⅡ组与 100 μM AngⅡ组之间的 TLR4 和 NF-κB p65的表达量无统计学差异(p>0.05)。观察SCD对Ang Ⅱ诱导的HK-2细胞氧化应激损伤的影响:根据12小时ROS检测的实验结果,AngⅡ组HK-2细胞中ROS的表达量与空白组相比有显著升高,差异有统计学意义(p<0.01),而各给药组中ROS的表达量与AngⅡ组相比均有显著降低(p<0.01),24小时下各组ROS表达量无统计学差异(p>0.05);SOD检测的实验结果显示,AngⅡ组HK-2细胞中SOD抑制率与空白组相比有显著升高,差异有统计学意义(p<0.01),各个给药组中SOD含量与AngⅡ组相比也有显著降低,差异有统计学意义(p<0.01);MDA检测的实验结果显示,AngⅡ组HK-2细胞中MDA表达量与空白组相比有显著升高,差异有统计学意义(p<0.01),与 Ang Ⅱ 组相比,AngⅡ+8 mg/ml SCD 组、AngⅡ+2 mg/ml SCD组HK-2细胞中MDA表达量有显著降低(p<0.01),卡托普利组HK-2细胞中MDA表达量降低,差异有统计学意义(p<0.05)。观察SCD对AngⅡ诱导的HK-2细胞炎症损伤的影响:WB结果表明,AngⅡ组HK-2细胞中TLR4的表达量与空白组相比有升高,差异有统计学意义(p<0.05),与AngⅡ组相比,AngⅡ+4 mg/ml SCD组、卡托普利组中TLR4蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(p<0.05),AngⅡ+8 mg/ml SCD组中TLR4蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(p<0.01);AngⅡ组HK-2细胞中NF-κB p65的表达量与空白组相比升高,差异有统计学意义(p<0.05),AngⅡ+8 mg/ml SCD 组、Ang Ⅱ+4 mg/ml SCD 组和卡托普利组 HK-2 细胞中 NF-κB p65的表达量与AngⅡ组相比有显著降低,差异有统计学意义(p<0.01),AngⅡ+2 mg/ml SCD组中NF-κB p65的表达量与AngⅡ组相比有降低,差异有统计学意义(p<0.05);AngⅡ组HK-2细胞中MYD88的表达量与空白组相比有升高,差异有统计学意义(p<0.05),AngⅡ+8 mg/ml SCD组细胞中MYD88蛋白表达量与AngⅡ组相比有降低,差异有统计学意义(p<0.05),卡托普利组中MYD88蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(p<0.01);AngⅡ组HK-2细胞中NLRP3的表达量与空白组相比有升高,差异有统计学意义(p<0.05),AngⅡ+8 mg/ml SCD组细胞中NLRP3的表达量与AngⅡ组相比有降低,差异有统计学意义(p<0.05),卡托普利组细胞中NLRP3的表达量与AngⅡ组相比有显著降低,差异有统计学意义(p<0.01);AngⅡ组HK-2细胞中BCL2的表达量与空白组相比,差异无统计学意义(p>0.05),AngⅡ+4mg/ml SCD组细胞中BCL2蛋白表达量与AngⅡ组相比有升高,差异有统计学意义(p<0.05),而卡托普利组中BCL2蛋白表达量与AngⅡ组相比有显著升高,差异有统计学意义(p<0.01);各组细胞中BAX的表达量均无统计学差异;AngⅡ组细胞中Caspase-1的表达量与空白组相比有所升高,差异有统计学意义(p<0.05),AngⅡ+2 mg/ml SCD组、AngⅡ+4 mg/ml SCD、AngⅡ+8 mg/ml SCD 组中 Caspase-1 蛋白的表达量与 AngⅡ组相比有降低,差异有统计学意义(p<0.05),卡托普利组细胞中Caspase-1蛋白相对表达量与AngⅡ组相比显著降低,差异有统计学意义(p<0.01)。4 结论4.1 SCD可以显著改善AngⅡ导致的HK-2细胞氧化应激损伤4.2 SCD可以通过TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路显著改善AngⅡ导致的HK-2细胞炎症损伤