研究背景和目的:子宫颈恶性肿瘤作为妇科第一位和女性第四位常见的恶性肿瘤,每年全球新发病例569,847例,因该病死亡311,365例,其中85%发生在发展中国家,死亡率在女性恶性肿瘤中位居首位[1]。目前子宫颈恶性肿瘤的主要治疗手段为手术、放疗,辅助化疗和靶向治疗等。子宫颈恶性肿瘤可以通过筛查获得早期诊断,常见的病理类型鳞癌和腺癌对放、化疗敏感,然而,大多数患者在初始治疗后的2年内发生复发和转移的风险较高,总体预后较差,中位生存期仅7个月。尽管包括抗血管生成的靶向治疗,程序性死亡受体1（programmed cell death protein-1,PD-1）及其配体（programmed cell death ligand protein-1,PD-L1）的单克隆抗体在内的靶向治疗、免疫治疗、过继细胞免疫治疗及疫苗等抗肿瘤作用的日益突显,子宫颈恶性肿瘤总生存期并无显著改善。因此,亟需探求更加有效的治疗手段改善子宫颈恶性肿瘤患者的生存质量和预后。蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin,MENK）,又名阿片生长因子（Opioid Growth Factor,OGF）,前体是前脑啡肽原和皮质素原,受体为阿片生长因子受体（Opioid Growth Factor Receptor,OGFr）,另外还有三种经典的μ、κ、δ阿片受体。阿片受体在体内分布广泛,相关研究提示MENK通过受体在炎症、慢性疼痛、自身免疫性疾病、慢性肝炎、糖尿病等疾病方便有良好的应用前景。越来越多的研究表明MENK作为一种双向的免疫调节剂不但对免疫细胞的免疫效能和免疫活性分子的释放发挥调节作用,同时亦对肿瘤有较强的抑制和杀伤作用,因蛋氨酸脑啡肽-阿片生长因子受体在众多肿瘤组织中均有表达,阿片生长因子受体作为蛋氨酸脑啡肽肿瘤研究中最主要的作用受体,其与蛋氨酸脑啡肽结合后可以调节核转录因子发挥抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡等作用。在我们课题组前期的研究中已经发现宫颈恶性肿瘤细胞中阿片生长因子受体有表达,关于MENK对宫颈恶性肿瘤生物学行为影响的相关研究尚未发现。本课题主要针对MENK对宫颈恶性肿瘤细胞生物学行为和凋亡的作用,以及肿瘤微环境的变化进行探讨,旨在揭示MENK在抑制宫颈恶性肿瘤的同时对体内微环境成分的变化,探索其与分子靶向联合个体化治疗宫颈恶性肿瘤的可能和应用前景。研究方法:1、体外,采用不同浓度的MENK（0、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mg/m L）分别作用于人子宫颈恶性肿瘤细胞Hela和Siha,作用时间为24,48,72小时。通过MTS实验选出MENK有效作用浓度10 mg/m L,作用48小时作为合适的作用剂量和时间进行后续实验;接下来,在此MENK浓度基础上,另外提前加用不同浓度的阿片受体拮抗剂那曲酮（naltrexone）(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 M)进行预处理,再给予MENK作用48小时检测其对MENK的阻断效果。最终选取10-4 M naltrexone作为阻断MENK的作用剂量,进行宫颈恶性肿瘤细胞后续的功能学等相关实验,观察MENK处理组与RPMI 1640空白对照组（Negative control,nc）比较,集落形成实验检测Hela和Siha细胞集落形成能力的变化;细胞划痕实验和transwell侵袭实验检测Hela和Siha细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测Hela和Siha细胞周期变化;流式细胞术和Hoechst 33258检查宫颈恶性肿瘤细胞凋亡变化情况;光学显微镜观察Hela和Siha细胞的形态改变。之后,收集MENK处理组与空白对照组的Hela和Siha细胞,提取mRNA和蛋白,qRT-PCR法检测caspase 3、caspase 8、caspase 9、vegfa的mRNA表达改变,Western blot检测caspase/cleaved caspase 3、caspase/cleaved caspase 8、caspase/cleaved caspase 9、vegfa的蛋白表达水平。2、体内,构建人宫颈恶性肿瘤裸鼠皮下移植瘤模型。位于裸鼠右侧后背部移植Siha细胞,观察成瘤后,将裸鼠随机分成两组:MENK给药组（8 mg/次,隔天一次）和空白对照组（等体积的等渗生理盐水,隔天一次）。每日观察裸鼠生命体征,行为变化,动态监测裸鼠体重和皮下瘤体积变化。给药约5周后颈椎脱臼法处死裸鼠,酒精消毒,切除皮下肿瘤和分离重要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行称重。制备肿瘤石蜡切片,做以下检测:HE检测组织病理。3、体内,构建小鼠宫颈恶性肿瘤模型来进一步明确免疫微环境的变化,位于裸鼠右侧后背部移植Siha细胞,每日观察至肿瘤出现后,将小鼠随机分成两组:MENK给药组（8 mg/次,隔天一次）和阴性对照组（等体积的等渗,隔天一次）,治疗约5周。麻醉状态下留取外周血,终止给予颈椎脱臼发处死小鼠,流式检测骨髓来源抑制细胞的标志性分子CD11b、Gr-1,以及免疫抑制性相关分子Arg-1、i NOS、IL-10、TGF-β、vegfa的水平。制备肿瘤石蜡切片,免疫组织化学法检测PD-1和PD-L1蛋白表达。4、信号通路验证,体外实验中,每个实验均设置MENK联合naltrexone用药组,naltrexone是阿片受体拮抗剂,两者联合以进一步明确MENK对宫颈恶性肿瘤细胞增殖、凋亡和生物学行为的影响是否由OGF介导。qRT-PCR及Western Blot检测OGFr和内源性和外源性凋亡相关指标的mRNA和蛋白的表达水平。结果:1、体外实验结果显示,与对照组比较,MENK可明显抑制Hela和Siha细胞的增殖,其作用具有显著的剂量依赖性。MENK可将宫颈恶性肿瘤细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期;诱导Hela和Siha细胞发生凋亡;降低Hela和Siha细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。MENK可上调cleaved caspase 3、cleaved caspase 8、cleaved caspase 9的蛋白质表达水平、降低vegfa的mRNA和蛋白质表达水平。2、MENK可抑制裸鼠皮下移植瘤生长,诱导移植瘤细胞的凋亡。小鼠重量和主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）在两组中无显著差异。免疫组化检测结果显示,MENK可上调OGFr、PD-1、PD-L1表达水平。3、体内实验中,流式结果提示:MENK可降低外周血中CD11b、Gr-1,即骨髓来源抑制细胞,以及免疫抑制性相关分子Arg-1、IL-10、TGF-β、vegfa的水平。免疫组化结果提示:小鼠肿瘤组织中OGFr、PD-1、PD-L1表达水平明显升高。4、MENK联合naltrexone后,MENK对Hela和Siha细胞增殖、侵袭、转移的抑制作用、细胞周期的影响和对凋亡的诱导作用明显削弱。qRT-PCR和Western Blot实验结果提示:MENK联合naltrexone可降低OGFr和fas/caspase8/caspase3和bax/caspase9/caspase3通路中相关效应分子的表达;逆转MENK对Hela和Siha细胞的作用。结论:1、体内外实验均证实,MENK在一定浓度和时间作用下有显著抑制宫颈恶性肿瘤增殖的作用。2、MENK可通过稳定细胞周期,促进细胞凋亡,遏制细胞迁移和侵袭,以及改善免疫微环境的免疫抑制状态重塑肿瘤微环境中的成分,增强的机体抗肿瘤免疫活性,发挥抑制宫颈恶性肿瘤行为的作用。3、MENK可显著上调宫颈恶性肿瘤细胞中OGFr的表达水平,与OGFr结合后触发抗肿瘤机制,调控外源性fas/caspase8/caspase3和内源性bax/caspase9/caspase3信号通路诱导宫颈恶性肿瘤Hela和Siha细胞凋亡。