目的慢性粒细胞白血病是造血系统的原发恶性疾病,是35岁以下发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。K562细胞是慢性粒细胞白血病细胞系中的一种急变细胞株,是人的造血干细胞向红系分化过程被Friends病毒感染,停止分化而形成的。经过多年研究,传统祖国医学对白血病的治疗具有很强的临床优势,很多中药制剂治疗白血病具有明显的疗效,本实验初步研究中药蟾酥对白血病耐药细胞株K562/ADR细胞在抑制生长、逆转耐药、诱导凋亡等方面的作用和影响,为蟾酥治疗难治/复发性急性白血病提供有益的细胞学、分子生物学依据。方法本研究以体外细胞培养实验为主,研究内容包括:(1)中药蟾酥血清药理学的实验方法;中药血清药理学是研究中药的一种较好的方法,但应区分不同的药物而采取不同的血清制备方案。在研究药理的同时,最好能和中药血清药化学结合起来,对有效成分能定性或定量分析,这对于中药的开发更具有实际意义。(2)MTT比色法观察蟾酥对细胞的抑制:取对数生长期细胞,调整细胞数为1×10~5/ml,将调整后的细胞悬液100ul加入96孔的酶标板中,每组设8个平行孔,每一板次测定,均设一列空白对照组,将酶标板放置于37℃、5%CO2浓度,饱和湿度条件下的培养箱内培养后,分别加入不同浓度的实验药物(实验药物包括:①生理盐水组②蟾酥高剂量组③蟾酥中剂量组④蟾酥低剂量组⑤蟾酥高剂量+柔红霉素组⑥蟾酥中剂量+柔红霉素组⑦蟾酥小剂量+柔红霉素组)分别培养不同时间后,于自动酶标仪检测各标本吸光度(OD)值。根据公式计算各实验组的药物对白血病细胞的细胞毒作用。(3)流式细胞术检测细胞凋亡率;收集以上分组作用后的细胞,用Annexin V和PI染色双染法对细胞进行一系列处理后,送流式细胞仪检测其各组的凋亡率。(4)用RT—PCR检测Survivin mRNA的表达。提取以上加入药物作用后的白血病细胞的RNA,逆转录反应cDNA,然后进行RT—PCR反应,获得数据。通过这些观察一般的项目和较新的、水平较高、较为公认的稳定的分子生物学指标,力求客观的反映中药蟾酥抗难治/复发性急性白血病的分子作用机制。结果(1)蟾酥可抑制K562/ADR耐药细胞的生长,药物浓度、作用时间与K562/ADR细胞生长抑制率之间均呈时效关系;(2)蟾酥作用48h后显微镜下观察到细胞形态出现凋亡特征;(3)随着药物浓度的增加和时间的推移,K562/ADR细胞中Survivin mRNA表达下降;(4)蟾酥随着药物浓度的增加,K562/ADR细胞凋亡率也增加。结论蟾酥可抑制K562/ADR细胞生长,逆转其耐药,促进细胞凋亡,呈剂量依赖性,其机制可能与Survivin mRNA表达下降有关。