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背景新生内膜形成是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、肺动脉高压、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous transluminal coronary intervention, PCI)术后再狭窄等血管增生性疾病共有的病理过程。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型转化在新生内膜形成过程中扮演着重要的角色。VSMCs有两种不同的表型状态,即分化/收缩型和去分化/合成型,两种表型在一定条件下可以相互转化.VSMCs由收缩型向合成型转化时,增殖、迁移能力增强并分泌、合成大量的细胞外基质,从而形成新生内膜,进而导致严重的血管增生性疾病的发生。如果能预防甚至逆转VSMCs表型转化,即可在早期遏制上述疾病的发生发展。目前,对VSMCs表型转化的机理研究发现,其主要由多种生长因子和机械性刺激所诱发,并通过多种信号通路将刺激信号传导至细胞核内,最终引起平滑肌分化标志基因表达的改变。然而,VSMCs表型转化的发生机制尚未完全明确,目前仍缺乏有效的干预措施。干扰素调节因子8(Interferon regμlatory factor8, IRF8),又名干扰素同源序列结合蛋白(interferon consensus sequence binding protein, ICSBP),其基因定位于染色体16q24.1,是哺乳动物干扰素调节因子家族(Interferon regμlatory factors, IRFs)的重要成员之一。国内外大量研究工作已证实,IRF8在免疫细胞分化中发挥重要作用。近期研究也表明,除天然免疫外,IRF8同时参与颈动脉斑块的形成并增加颈动脉内膜和中膜厚度,提示IRF8可能在VSMCs表型转化和新生内膜形成中发挥重要的作用。本实验通过建立小鼠左颈动脉导丝损伤模型,运用IRF8基因敲除及平滑肌特异转基因小鼠探讨IRF8在VSMCs表型转化和新生内膜形成中的作用,并进一步阐明其可能的分子机制。目的阐明IRF8对颈动脉导丝损伤诱导的VSMCs表型转化和新生内膜形成中的影响和作用,并探讨其可能的分子机制。方法第一部分：选取体重24～28g、10～12周龄的雄性C57BL/6为背景的野生型(Wild type,WT)小鼠为实验对象并建立左颈动脉导丝损伤模型。将小鼠随机分为4组：假手术组(sham)、血管损伤术后7天组、14天组和28天组。采用Western Blot、免疫荧光染色检测血管损伤后不同时间点颈动脉组织IRF8蛋白表达水平。同时应用血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF-BB)刺激原代大鼠主动脉平滑肌细胞(Rat aortic smooth muscle cells, RASMCs)人主动脉平滑肌细胞(Human aortic smooth muscle cells, HASMCs)建立体外血管内膜增生模型,通过Western Blot检测PDGF-BB刺激前后IRF8蛋白表达水平。第二部分：选取体重24-28g、10～12周龄的雄性野生型IRF8基因敲除小鼠(IRF8-KO)和WT对照组小鼠为实验对象并建立颈动脉导丝损伤模型。WT和IRF8-KO小鼠分别随机分为Sham组和损伤组。血管损伤术后14和28天后利用H&E染色进行形态学检测；通过免疫荧光染色和Western Blot检测平滑肌特异基因的表达。同时,应用PDGF-BB(20ng/ml)刺激VSMCs,Western Blot检测腺病毒介导的IRF8基因敲低(AdshIRF8)或IRF8基因敲除后对VSMCs表型分子表达的影响。通过BrdU掺入实验检测IRF8敲除后对VSMCs增殖的影响。第三部分：应用显微注射技术,构建平滑肌特异IRF8转基因小鼠(IRF8-TG)。选用24-28g、10-12周龄的IRF8-TG雄性小鼠及NTG对照组小鼠建立颈动脉导丝损伤模型。将NTG和IRF8-TG小鼠分别随机分为假手术组和手术组。血管损伤14和28天后,H&E染色进行形态学评价；通过免疫荧光染色和Western Blot检测平滑肌特异基因的表达。同时,应用PDGF-BB(20ng/ml)刺激VSMCs,WesternBlot检测腺病毒介导的IRF8过表达(AdIRF8)或平滑肌特异IRF8转基因对VSMCs表型分子表达的影响。应用BrdU掺入实验检测平滑肌特异IRF8转基因对VSMCs增殖的影响。第四部分：应用双荧光素酶报告基因系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)检测过表达IRF8对平滑肌特异基因启动子上保守反应元件CArG活性和平滑肌特异基因SM22a转录活性的影响。应用点突变方法将SM22a基因转录起始位点上游-107,+16位点的CArG元件进行突变,并构建相应的SM22a荧光素酶报告基因突变载体。我们采用Gal4-UAS系统,构建Ga14-Myocardin嵌合体转录因子,并将携带Gal4-Myocardin腺病毒转染A7r5及RASMCs,观察腺病毒介导的IRF8过表达对UAS转录活性的影响。通过免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)和GST-Pulldown方法确定IRF8与Myocardin之间是否存在直接的相互作用。应用Confocal激光扫描生物荧光显微镜和图像分析软件明确IRF8与Myocardin是否共定位。应用构建不同的截短突变表达质粒并分别进行IP实验识别IRF8与Myocardin相互作用的关键结构域。进一步通过构建与Myocardin相互作用所必须的IRF8N末端的DBD结构域及中间结构域突变表达载体(Admutant)并体外转染原代RASMCs,明确IRF8对平滑肌特异基因表达的影响。结果第一部分：在WT小鼠颈动脉导丝损伤模型中,H&E染色结果显示,血管损伤后7d、14d及28d,内膜面积(intima area)及内膜面积和中膜面积比值(I/M)随着时间的推移逐渐加重。Western Blot结果显示,假手术时,小鼠颈动脉组织IRF8蛋白表达水平较低,损伤后7d略升高,14d时达最高峰,至28d时回到较低水平。免疫荧光染色结果表明IRF8主要表达于VSMCs,且14d达最高峰。体外研究结果发现,未给予PDGF-BB刺激时,RASMCs和HASMCs两种类型的细胞中IRF8蛋白表达水平均较低,PDGF-BB(20ng/ml)处理后,IRF8的蛋白表达明显上调,24h表达最高。第二部分：在WT和IRF8-KO小鼠颈动脉导丝损伤模型中,H&E染色结果显示,与WT组小鼠相比,IRF8-KO组小鼠在血管损伤14d和28d后内膜面积和I/M值均降低。免疫荧光染色和Western Blot结果显示,血管损伤14d和28d后,IRF8-KO组小鼠VSMCs收缩蛋白(α-SMA,SM22α, smoothelin,desmin)的表达均显著高于WT组；而合成型平滑肌特异基因骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的表达明显低于WT组。体外研究结果显示,经转染AdshIRF8组或IRF8-KO组VSMCs, PDGF-BB处理后,VSMCs收缩蛋白a-SMA,SM22α smoothelin和desmin的表达均明显高于WT组,而PCNA、CyclinD1及MMP9的表达则显著低于WT组。BrdU掺入结果显示,给予PDGF-BB处理后,IRF8-KO组VSMCs BrdU掺入明显低于WT组。第三部分：我们成功构建了四株以C57BL/6为背景的平滑肌特异IRF8转基因小鼠,IRF8的表达由小鼠SM22启动子驱动。Vestern blot结果显示,与WT组相比,TG4株转基因小鼠IRF8蛋白表达最高,约为WT组的14.3倍。在NTG和IRF8-TG小鼠颈动脉导丝损伤模型中,H&E染色结果显示,血管损伤14d和28d后,IRF8-TG组小鼠内膜面积和I/M比值较NTG组显著加重。免疫荧光染色和Western Blot结果显示,与NTG组相比,IRF8-TG组VSMCs收缩蛋白a-SMA, SM22α、smoothelin和desmin的表达明显降低,而合成型蛋白OPN的表达水平显著升高。体外研究结果显示,转染AdIRF8组VSMCs和IRF8-TG组VSMCs, PDGF-BB处理后,VSMCs收缩蛋白(α-SMA,SM22α,smoothelin和desmin)的表达均明显低于对照组,而PCNA、CyclinD1及MMP9的表达显著高于对照组。BrdU掺入结果显示,PDGF-BB处理后,IRF8-TG组VSMCs的BrdU掺入较NTG组明显上调。第四部分：用AdGFP和AdMyocardin分别感染原代RASMCs,双荧光素酶报告基因检测结果显示,AdMyocardin组的3×CArG和SM22报告基因活性均明显高于AdGFP组;而AdIRF8+AdMyocardin共转染原代RASMCs后,AdIRF8+AdMyocardin组的3×CArG和SM22报告基因活性未发生改变。CArG元件突变结果显示,AdMyocardin感染原代RASMCs组,突变的SM22启动子活性显著低于WT组,而转染AdMyocardin+AdshIRF8组,WshIRF8增加WT及单个位点突变的SM22启动子活性,而对M1、M2两个位点均突变的SM22转录活性无影响。Ga14/UAS系统结果显示,Ga14-Myocardin腺病毒感染A7r5细胞和RASMCs后,UAS荧光素酶活性显著升高,而共转染Ga14-Myocardin和IRF8腺病毒组UAS荧光素酶活性被显著抑制。CO-IP结果显示,IRF8蛋白与Myocardin蛋白之间可以相互结合,GST-pulldown实验进一步证实了其直接的相互作用。Confocal激光扫描生物荧光显微镜和图像软件分析发现,IRF8和Myocardin两者共定位于细胞核中。多个位点截短实验和Co-IP结果显示,Myocardin的C末端转录激活区(transcriptional activation domain, TAD)能够与IRF8相互结合。而IRF8的N末端DNA结合域(DNA-binding domain, DBD)及中间结构域均能与Myocardin相互作用。IRF8与Myocardin相互作用结构域突变位点结果显示,转染AdMyocardin+AdIRF8的原代RASMCs组,3×CArG及SM22报告基因活性显著低于AdMyocardin;而Admutant+AdMyocardin组与AdMyocardin组相比,CArG及SM22报告基因活性无明显差异。结论1.在小鼠颈动脉导丝损伤模型中,IRF8的蛋白表达水平显著升高,并且主要表达于VSMCs。2.IRF8基因敲除抑制血管损伤诱导的VSMCs表型转化和内膜增生；而平滑肌特异过表达IRF8则促进血管损伤诱导的VSMCs表型转化和新生内膜的形成。3.IRF8通过与Myocardin直接相互作用调控血管损伤诱导的VSMCs表型转化和新生内膜的形成。