目的:本研究拟将外用中药瘿肿消开发成软膏剂型的院内制剂,确定瘿肿消软膏制备工艺,制定质量标准并考察稳定性,完成药效学研究并初步揭示其疗效机制,通过毒性实验对瘿肿消软膏非临床安全性进行评价,随机对照试验评价瘿肿消穴位贴敷对结节性甲状腺肿的治疗效果。材料与方法:第一部分为瘿肿消软膏制备工艺研究:对药品粉碎工艺进行考察,采用加权评分法考察瘿肿消软膏基质处方、渗透促进剂、基质药粉比例、水油混合方法、乳化温度及防腐剂进行考察,通过中试放大确认工艺稳定性。第二部分为瘿肿消软膏质量标准研究与稳定性研究:对瘿肿消软膏外观形状作出规定,对三批样品进行装量、粒度、微生物检查,薄层色谱法对大黄、栀子、青黛、夏枯草、浙贝母、莪术进行鉴别,高效液相法进行含量测定和方法学研究,根据多次测量结果对瘿肿消软膏含量限度进行规定,制定质量标准草案。采用常温留样法与加速加温法对瘿肿消软膏稳定性进行考察。第三部分为瘿肿消软膏的药效学研究:选取SPF级4周龄Wistar大鼠70只,雌雄各半,适应性饲养一周后,从中随机选取10只为正常组,其余大鼠采用剂量为0.01g/（kg·d）PTU灌胃进行甲状腺肿模型制备,连续灌胃14天,将60只成模大鼠按随机对照表随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、湿敷组、LT₄组6组,每组10只。从第15天起,正常组、模型组大鼠正常饲养,其余大鼠颈部以6%硫化钠脱毛,低剂量组予生药含量0.45g/（kg·d）瘿肿消软膏日1次外敷,中剂量组予生药含量0.9g/（kg·d）的瘿肿消软膏日1次外敷,高剂量组予生药含量1.8g/（kg·d）的瘿肿消软膏日1次外敷,湿敷组大鼠予不含生药的软膏基质日1次颈部外敷,软膏均匀涂抹于颈部,覆盖厚度约为0.2cm,医用纱布包裹,无刺激性胶带固定,LT₄组予0.2μg/（kg·d）LT₄水溶液日一次灌胃,连续干预28天。干预结束后,腹腔注射麻醉,留取各组大鼠血清、甲状腺组织。采用ELISA法检测大鼠血清TT₃、TT₄、TSH含量,HE染色方法观察大鼠甲状腺组织形态,RT-PCR法检测大鼠甲状腺组织PI3K/Akt/mTOR信号通路mRNA表达,Western blot法检测大鼠甲状腺组织Beclin-1、LC3蛋白表达,免疫组织化学法检测大鼠甲状腺组织Fas、FasL表达。第四部分为瘿肿消软膏的毒性研究:急性毒性实验选取新西兰大耳白兔20只,体重2±0.2kg,雌雄各半,适应性喂养1周后,脊柱两侧6%硫化钠水溶液去毛,去毛后按性别体重分层随机分为赋形剂对照组、完整皮肤高剂量组、完整皮肤低剂量组、破损皮肤高剂量组、破损皮肤低剂量组5组,每组4只。破损皮肤组动物使用#400砂纸磨擦暴露处皮肤,以渗血为度。对照组给予赋形剂,完整及破损皮肤高剂量组均涂抹高剂量瘿肿消软膏剂（生药含量0.3g/g）,完整及破损皮肤低剂量组均涂抹低剂量瘿肿消软膏剂（生药含量0.1g/g）。观察并记录去除药品后1h,24h,48h,72h至第七日,各组受试动物的体重、皮肤毛发、眼和粘膜的变化、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等及其他中毒表现,评估完整皮肤及破损皮肤组短时间接触受试物所产生的毒性反应;长期毒性实验选取新西兰大耳白兔30只,体重2±0.2 kg,雌雄各半,适应性喂养1周后,脊柱两侧6%硫化钠水溶液去毛。按性别体重分层随机分为对照组、完整皮肤高剂量组、完整皮肤低剂量组、破损皮肤高剂量组、破损皮肤低剂量组5组,每组6只。破损皮肤组动物使用#400砂纸磨擦暴露处皮肤,以渗血为度。对照组脊柱两侧受试区域涂抹赋形剂,其余各组给予相应瘿肿消软膏每日给药2次,每次持续6h,连续给药12周,观察并记录各组受试动物体重、皮肤状况、全身症状、中毒表现及恢复程度。第12周末次给药后,随机选取每组4只受试动物,禁食水24h后处死,进行取材及指标检测,余动物停药观察2周后,禁食水24h后腹腔麻醉处死,取家兔腹主动脉血及各脏器。血细胞分析仪检测各组家兔血细胞变化,生化分析仪检测生化法测定各组家兔肝功能、肾功能、血糖、血脂变化。重要脏器及用药部位皮肤固定脱水后行HE染色做组织病理学检查。第五部分为瘿肿消穴位贴敷治疗结节性甲状腺肿的临床研究:选取2018年3月至2019年03月在辽宁中医药大学附属医院内分泌科门诊的气滞痰瘀、郁久化火型结节性甲状腺肿患者,采用随机数字表法随机分为治疗组与对照组,治疗组应用瘿肿消穴位贴日2次贴敷于患侧扶突穴、水突穴,每次3小时,连续治疗8周。对照组患者为阴性对照,不采取治疗措施,观察8周后访视。记录两组患者试验前后甲状腺彩超所示左叶前后径、右叶前后径、峡部厚度,最大结节直径。制定中医证候积分表,于试验前后对两组患者进行评分。参考2002年版《中药临床新药指导原则》分别制定基于彩超表现及中医证候积分疗效判定标准,评价瘿肿消穴位贴敷治疗结节性甲状腺肿疗效。两组治疗前后的变化采用配对样本t检验或非参数检验,两组间疗效比较采用独立样本t检验或非参数检验或卡方检验。结果:1.本制剂制备工艺为:取大黄、栀子、浙贝母、夏枯草、莪术、薄荷粉碎成细粉,冰片研细,与细粉及青黛混匀,称重,加入9倍量冷却至40℃基质（基质制法:硬脂酸400g,液体石蜡500g,凡士林500g,单硬脂酸甘油酯400g,氮酮400g作为油相,甘油600g,三乙醇胺100g,尼泊金乙酯10g,蒸馏水适量作为水相,分置两个容器内,加热至80℃全部熔化,水相加入油相中,不断搅拌,制成基质）搅拌均匀,制成10000g。2.三批次瘿肿消软膏装量检查、粒度检查、微生物检查均符合药典要求。对方中六味药进行薄层色谱鉴别研究,最终因大黄、栀子、青黛鉴别重现性和专属性良好而收入标准。确定瘿肿消软膏中栀子以栀子苷计,不得少于0.3mg/g。制定了瘿肿消软膏质量标准草案。在为期6个月的考察期,采用常温留样法和加温加速试验法对3批次瘿肿消软膏的性状、定性鉴别、含量测定及相关检查等指标进行检测,均符合规定。3.（1）各组大鼠体重无统计学差异（P>0.05）。与正常组相比,各组大鼠甲状腺重量与相对重量显著增加（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组甲状腺重量与相对重量无统计学差异（P>0.05）,瘿肿消各剂量组及LT₄组甲状腺重量与相对重量显著下降（P<0.01）;与LT₄组相比,低剂量组甲状腺重量与相对重量无显著差异（P>0.05）,中剂量组与高剂量组甲状腺重量降低（P<0.05）,甲状腺相对重量显著降低（P<0.01）;与低剂量组相比,中剂量组与高剂量组甲状腺重量及相对重量降低（P<0.05）;中剂量组与高剂量组甲状腺重量与相对重量无差异（P>0.05）。（2）正常组甲状腺滤泡呈中等大小,上皮细胞立方状或扁平状,排列规则,内部均匀充满胶质。滤泡间的疏松结缔组织无异常增生,周围可见少量毛细血管;模型组甲状腺滤泡过度扩张,大小差别明显,排列不规则,腔内胶质含量明显减少,上皮细胞呈高度增生相,滤泡之间界线模糊,被数量不等的纤维组织分隔,可见炎性细胞浸润;与模型组相比,湿敷组形态较为相似。瘿肿消各剂量组与LT₄组可见甲状腺组织形态及滤泡趋于恢复。（3）各组大鼠血清TT₃组间无显著性差异（P>0.05）。与正常组相比,各组大鼠血清TT₄均显著降低（P<0.01）;与模型组相比,LT₄组大鼠血清TT₄升高（P<0.05）,其余各组无统计学差异（P>0.05）;与LT₄组相比,低剂量组、高剂量组与湿敷组TT₄水平较低（P<0.05）;瘿肿消各剂量间无统计学差异（P>0.05）。与正常组相比,各组大鼠血清TSH均显著升高（P<0.01）;与模型组相比,LT₄组大鼠血清TSH显著降低（P<0.01）,其余各组无统计学差异（P>0.05）;与LT₄组相比,瘿肿消各剂量组TSH均显著上升（P<0.01）;瘿肿消各剂量组间无统计学差异（P>0.05）。（4）与正常组相比,其余各组PI3K mRNA表达均增高（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组PI3K mRNA表达情况无统计学差异（P>0.05）,各剂量组及LT₄组表达均下降（P<0.01）;与LT₄组相比,低剂量组PI3K mRNA表达未见统计学差异（P>0.05）,中剂量及高剂量组明显下降（P<0.01）;与低剂量组相比,中剂量及高剂量组表达情况显著降低（P<0.01）。与正常组相比,其余各组Akt mRNA表达均增高（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组Akt mRNA表达情况未见统计学差异（P>0.05）,各剂量组及LT₄组表达均下降（P<0.01）;与LT₄组相比,低剂量组Akt mRNA表达未见统计学差异（P>0.05）,中剂量及高剂量组明显下降（P<0.01）;与低剂量组相比,中剂量及高剂量组表达情况显著降低（P<0.01）。与正常组相比各组mTOR mRNA表达均增高,中剂量组及高剂量组存在统计学差异（P<0.05）,模型组、湿敷组、低剂量组、LT₄组有显著差异（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组mTOR mRNA表达未见差异（P>0.05）,其余各组表达量有所下降,低剂量组及LT₄组具有统计学差异（P<0.05）,中剂量组及高剂量组存在显著差异（P<0.01）;与LT₄组相比,低剂量组mTOR mRNA表达无统计学差异（P>0.05）,中剂量、高剂量组表达下降（P<0.05）;瘿肿消各剂量组之间相比,中剂量组、高剂量组表达均低于低剂量组（P<0.05）;中剂量、高剂量两组组间无统计学差异（P>0.05）。（5）与正常组相比,LT₄组Beclin-1蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,湿敷组Beclin-1蛋白表达升高（P<0.05）,余各组均显著升高（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组Beclin-1蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,LT₄组表达增高（P<0.05）,各剂量组表达显著增高（P<0.01）;与LT₄组相比,瘿肿消各剂量组表达均显著增加（P<0.01）;与低剂量组相比,中剂量组、高剂量组表达均增加（P<0.05,P<0.01）。与正常组相比,各组LC3Ⅱ/Ⅱ表达均显著下降（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组LC3Ⅱ/Ⅱ无统计学差异（P>0.05）,其余各组均显著升高（P<0.01）;与LT₄组相比,低剂量组无统计学差异（P>0.05）,中剂量和高剂量组LC3Ⅱ/Ⅱ表达增加（P<0.05）;与低剂量组相比,中剂量组、高剂量组LC3Ⅱ/Ⅱ表达均增加（P<0.05）。（6）与正常组相比,模型组Fas阳性表达增强（P<0.05）,其余各组显著增强（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组表达无差异（P>0.05）,LT₄组表达增强（P<0.05）,其余各组显著增强（P<0.01）;与LT₄组相比,瘿肿消各剂量组表达均显著增强（P<0.01）;与低剂量组相比,中剂量组、高剂量组表达显著增强（P<0.01）。与正常组相比,其余各组FasL阳性表达均显著增加（P<0.01）;与模型组相比,湿敷组、低剂量组与LT₄组FasL阳性表达平均光密度值无统计学差异（P>0.05）,中剂量和高剂量组FasL表达显著增强（P<0.01）;与LT₄组相比,瘿肿消各剂量组FasL阳性表达均显著增强（P<0.01）;与低剂量组相比,中剂量组和高剂量组表达显著增强（P<0.01）。4.（1）急性毒性试验:24h干预给药后,1h至7d观察各组全部动物存活,体重未见异常变化,行为活动正常,毛发润泽光亮,眼和粘膜未出现异常变化,饮食饮水量及排尿排便均未见明显改变。完整皮肤组受试皮肤均未出现红斑及水肿,破损皮肤组于去除受试物后结痂脱落,创面未出现红斑及水肿且恢复正常。（2）长期毒性试验:给药期及观察期间,各组全部动物存活,体重未见异常变化,行为活动正常,毛发润泽光亮,眼和粘膜未出现异常变化,饮食饮水量及排尿排便均未见明显改变。完整皮肤组受试皮肤均未出现红斑及水肿,破损皮肤组结痂脱落后,创面均恢复正常。与对照组相比较,不同剂量的完整皮肤组、破损皮肤组干预均未对受试动物体重产生明显影响。与对照组相比较,干预12周及停药观察2周后,不同剂量的完整皮肤组、破损皮肤组干预对受试动物外周血细胞均无显著影响（P>0.05）。与对照组相比较,干预12周及停药观察2周后,不同剂量的完整皮肤组、破损皮肤组干预对受试动物肝功能、肾功能、血脂、血糖均无显著影响（P>0.05）。与对照组相比较,干预12周及停药观察2周后,不同剂量的完整皮肤组、破损皮肤组干预对受试动物脑、心、肺、肝、脾、肾、肾上腺、性腺等重要脏器系数无显著影响（P>0.05）。与对照组相比较,干预12周及停药观察2周后,各组受试动物脑、心、肺、肝、脾、肾、肾上腺、性腺等重要脏器及受试部位皮肤行肉眼观察及HE染色病理学观察,未见明显差异,未见刺激性炎症变化。5.临床研究共纳入44例结节性甲状腺肿患者,治疗组22例,对照组22例,两组间基线可比。比较两组患者试验前后甲状腺彩超表现变化,治疗组治疗后左叶前后径、右叶前后径缩小,差异均具有统计学意义（P<0.05）,峡部厚度及最大结节直径治疗前后差异无统计学意义（P>0.05）。对照组试验前后左叶前后径、右叶前后径、峡部厚度及最大结节直径变化均无统计学意义（P>0.05）;比较两组患者试验前后中医证候积分变化,结果表明治疗组治疗后中医证候积分显著降低,差异均具有统计学意义（P<0.01）,对照组中医证候积分变化无统计学意义（P>0.05）;比较两组基于甲状腺彩超表现的治疗有效率,治疗组总有效率为45.45%,对照组总有效率为13.64%,两组组间总有效率差异具有统计学意义（P<0.05）;比较两组基于中医证候积分的治疗有效率,治疗组总有效率为77.27%,对照组总有效率为9.09%,两组组间总有效率差异具有统计学意义（P<0.01）;比较两组试验前后甲状腺功能、肝功能、肾功能变化,与治疗前相比,相关指标变化均无统计学差异（P>0.05）。结论:1.瘿肿消软膏制备工艺合理可行,质量标准可控,成品具有良好的稳定性,是安全的局部外用制剂,具备开发为院内制剂条件;2.瘿肿消软膏外敷可以缩小甲状腺肿大鼠甲状腺体积,恢复甲状腺形态,其疗效机制可能与下调甲状腺肿大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路基因表达,促进自噬相关蛋白Beclin-1蛋白表达、LC3Ⅱ/Ⅱ比值上升,促进凋亡相关因子Fas、FasL表达有关;3.瘿肿消穴位贴敷治疗结节性甲状腺肿能缩小患者甲状腺两叶前后径,降低中医证候积分,对甲状腺功能、肝功能与肾功能无明显影响,安全有效。