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背景:单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus-1,HSV-1）是一种噬神经组织的双链DNA病毒,人类是其唯一的自然宿主。流行病学显示,全球有50-90%的人携带HSV-1病毒。HSV-1感染角膜引起的角膜病,约50%-80%均表现为上皮性角膜炎。尽管HSV角膜上皮炎在一周之内即可自行消退,但如果没有适当的治疗,仍可能会进展为基质性角膜炎,导致进行性角膜混浊。迄今为止,关于HSV上皮性角膜炎的发病机制仍不明确。基于HSV-1感染特性,临床上常采用更昔洛韦等抗病毒药物作为治疗HSV角膜上皮炎的首选药物。然而长期使用抗病毒药物会导致病毒株的耐药性。因此,控制HSV-1感染仍然是一个巨大的挑战,目前迫切需要开发更有效的防御及治疗措施。三基序蛋白（Tripartite motif-containing proteins,TRIMs）家族是一类含有多个结构域的生物大分子,TRIMs蛋白家族成员众多,因其C-末端连接的不同结构域,发挥不同的功能作用。近期研究表明,C-末端的B30.2结构可以识别入侵的病毒,在病毒感染的过程中发挥至关重要的作用。TRIM21也称为Ro52或SS-A,其介导的免疫反应主要发生在细胞质内。一旦病原体感染细胞并进入细胞质,TRIM21就会迅速检测到与抗体结合的病原体。一方面通过招募蛋白酶体快速降解病原体/抗体复合物,另一方面通过泛素信号等途径激活固有免疫信号通路,两者可同时发生,产生大量的促炎细胞因子。近期研究表明,TRIM21具有招募蛋白酶体并分解衣壳的能力,因此可以过早暴露外源性病毒基因组,以促进模式识别受体的激活。HSV-1属于包膜病毒,由此我们猜测TRIM21可能会影响HSV-1的感染。目的:在C57BL/6J小鼠单纯疱疹性角膜上皮炎模型的研究中,明确TRIM21在HSV-1诱导的角膜炎中存在异常表达;明确沉默角膜中TRIM21对HSV角膜上皮炎疾病程度的影响,并初步探索TRIM21在HSV-1感染角膜急性期的作用机制;在人角膜上皮细胞系（HCE细胞）的研究中,探讨TRIM21调控I型干扰素信号影响HSV-1病毒复制的作用机制。方法:首先利用角膜划痕法在C57BL/6J小鼠的角膜上皮接种HSV-1病毒,诱导单纯疱疹性角膜上皮炎模型,结合免疫荧光技术和Western Blotting实验方法,探索TRIM21在HSV角膜上皮炎中的异常表达。随后使用小干扰RNA技术沉默小鼠角膜中的TRIM21表达,观察角膜感染HSV-1后的病程特点,结合qPCR和ELISA实验方法检测促炎细胞因子以及I型干扰素的产生量,初步探索TRIM21在HSV-1感染角膜的急性期对固有免疫系统的作用机制。利用HCE细胞研究TRIM21影响HSV-1复制的作用机制。为了干扰TRIM21的表达,我们使用TRIM21的小干扰RNA和高表达慢病毒质粒转染HCE细胞,并用其各自的空载体做阴性对照。结合Western Blotting和qPCR实验方法对STING-IRF3信号通路相关蛋白进行检测,明确TRIM21调控Ⅰ型干扰素信号的作用机制。结果:研究发现C57BL/6J小鼠无病原体感染的角膜中有TRIM21的本底表达;小鼠角膜感染HSV-1病毒后,角膜中的TRIM21表达量增加显著（P<0.05）,且免疫荧光结果显示异常高表达的TRIM21定位于角膜上皮层,这些结果表明TRIM21参与HSV角膜上皮炎的发生发展。利用siRNA-TRIM21沉默角膜中TRIM21的表达,随之感染HSV-1病毒,观察沉默TRIM21对HSV角膜上皮炎疾病严重程度的影响。研究发现,TRIM21沉默组的角膜混浊程度显著低于TRIM21沉默对照组（P<0.05）。角膜感染HSV-1后第3天,TRIM21沉默组中8/8的角膜病变评分≤2,而沉默对照组中仅有1/8的角膜病变评分≤2。通过显微镜观察和组织病理学HE染色,探索TRIM21沉默对角膜组织结构及炎症细胞浸润情况。研究发现,未感染HSV-1病毒的正常对照组小鼠角膜上皮光滑透明,HE染色显示角膜上皮层平滑完整,细胞排列规则,基质层内仅有少量基质细胞,内皮细胞层完整;在感染后第3天,TRIM21沉默对照组的小鼠角膜可见角膜上皮混浊,HE染色显示角膜上皮层明显增生,上皮细胞变大,细胞数量增多,细胞排列紊乱,有空泡状改变,基质层轻度水肿增厚,伴随少量的炎症细胞浸润;然而TRIM21沉默组的小鼠角膜混浊程度、角膜上皮层增生程度以及细胞排列紊乱程度等均低于TRIM21沉默对照组。随后我们采用TCID50法检测泪液膜中HSV-1的病毒滴度。研究发现,感染HSV-1后第一天,泪液膜中HSV-1的病毒滴度最高,随着感染天数的增加,病毒滴度呈下降趋势。与TRIM21沉默对照组相比,TRIM21沉默组泪液膜中的病毒滴度被显著抑制（P<0.05）。与病毒滴度结果一致,TRIM21沉默组角膜中的I型干扰素表达量约是沉默对照组的2倍。于小鼠右眼角膜接种HSV-1后第3天,获取右眼角膜提取蛋白后使用ELISA法检测促炎细胞因子IL-6和TNF-a的表达水平。研究发现,IL-6和TNF-a在HSV角膜上皮炎中有表达,与沉默对照组相比,两者在TRIM21沉默组的角膜中表达量被显著抑制（P<0.05）。在HCE细胞上,先做干扰TRIM21表达的预处理,再接种HSV-1病毒。利用qPCR技术检测干扰TRIM21表达后,对Ⅰ型干扰素信号IFN-a的影响。研究结果显示,经预处理沉默TRIM21的HCE细胞,感染HSV-1病毒后,其IFN-a表达量上调;经预处理高表达TRIM21的HCE细胞,感染HSV-1病毒后,其IFN-a表达量下调。Western Blotting法检测干扰TRIM21表达后,对STING-IRF3信号通路的影响。研究结果显示,沉默TRIM21后,STING和磷酸化IRF3表达增强;相反,高表达TRIM21后,STING和磷酸化IRF3表达减弱。接下来我们同时使用siRNA-TRIM21和siRNA-STING对HCE细胞进行预处理,感染HSV-1病毒12小时后,qPCR法检测HCE细胞中IFN-a的表达量。结果显示,同时下调TRIM21和STING后,与单独下调TRIM21相比,IFN-a的表达量明显下降。结论:TRIM21在C57BL/6J小鼠的正常角膜上有本底表达。HSV-1感染小鼠角膜后,诱导角膜内TRIM21表达增强。沉默角膜中TRIM21表达后,增强了Ⅰ型干扰素产生,导致泪液膜表面的病毒滴度显著降低;同时抑制了促炎细胞因子IL-6和TNF-a的表达,进而减轻了免疫炎症反应对角膜的病理性损伤,有效缓解了角膜混浊程度。进一步在人角膜上皮细胞感染HSV-1的研究中发现,TRIM21通过抑制STING-IRF3信号通路,限制I型干扰素产生,维持HSV-1病毒在角膜中的复制能力。