bHLH蛋白是一类在真核生物细胞中重要而保守的转录因子。它们都含有一个保守的bHLH区域，该区域由一个碱性氨基酸区段和两个双亲的a-螺旋组成，其中在两个两亲的a-螺旋中间是一个长度不定的loop区段。两个相同或不同的bHLH蛋白之间可形成同源或异源二聚体，二聚体中的每个蛋白各结合E-box(CANNTG)的一半序列以调节基因的转录。在动物中，bHLH蛋白介入了许多重要的发育过程，如细胞分裂、组织特异性、细胞系谱决定等。但是到目前为止，在植物中，只有极少数bHLH基因的功能被详细研究过。在拟南芥中已经发现162个编码bHLH转录因子的基因，它们中大多数成员的功能有待进一步的研究。在本论文中，我们研究了拟南芥中两个可能的bHLH转录因子(AtBHLH29和AtBHLH101)在铁元素吸收和利用过程中的调节作用，获得了以下结果。 在铁充足条件下，AtBHLH29基因主要在野生型拟南芥的根部转录，在植株的茎、叶、花、荚果中的转录水平很低。缺铁在一定程度上增加了根部AtBHLH29的转录水平，但其增加趋势却明显小于AtFRO2基因在根部的增加趋势。利用RNA干涉的方法，我们创建了一系列AtBHLH29基因的减量表达(knock-down)突变体。在50μMFe(Ⅲ)的培养条件下，减量表达突变体中AtBHLH29基因的转录水平呈逐渐减少的趋势，而且这些突变体也显示出不同程度的失绿现象，其失绿程度与AtBHLH29基因转录水平的降低和植株中的铁含量呈正相关。此外，当把突变体植株转移至100μMFe(Ⅲ)的培养条件下，其失绿现象会得到一定程度的恢复。R111和R119株系是失绿现象最严重的两个株系，当把它们种植在缺铁条件下，其幼苗变黄，且长至2-3叶时就会死亡。R111和R119株系与野生型植株金属含量比较发现，RNAi株系铁、锌含量明显低于野生型植株，相反，锰的含量却明显高于野生型植株。相对于铁、锌和锰，铜的含量在RNAi株系和野生型植株之间没有明显差别。利用半定量RT-PCR，我们发现AtBHLH29的转录水平与拟南芥三价铁还原酶基因(AtFRO2)和高亲和力铁转运蛋白基因(AtIRT1)的转录水平存在相关性，在铁充足条件下，AtFRO2和AtIRT1的转录水平在野生型中最高，其次为R18，R119中最低，几乎检测不到；铁缺乏导致AtFRO2和AtIRT1转录水平的诱导增加，这种增加在野生型中最高，在R18和R119中较弱。这些结果表明AtBHLH29在高铁和低铁条件下对拟南芥的铁吸收过程都有调节功能。在高铁条件下，AtBHLH29对拟南芥铁吸收是有益的，但不是决定性的，因为即使失绿最严重的RNAi也能够生长并结实。在低铁条件下，AtBHLH29对拟南芥的铁吸收是至关重要的，因为失绿最严重的RNAi株系在幼苗时期死亡。 运用农杆菌介导的转化方法，在拟南芥的野生型植株中过量表达AtBHLH29基因，RT-PCR实验确证在三个转基因株系(OVER-3、OVER-4、OVER-11)中AtBHLH29基因呈过量表达。初步试验表明过量表达AtBHLH29基因的转基因植株与野生型植株相比并没有明显的表型。在铁充足条件下，所有转基因株系中AtFRO2和AtIRT1的转录水平都高于野生型，但AtFRO2和AtIRT1的增加与AtBHLH29的增加之间不存在明显的相关性。这些结果表明虽然AtBHLH29在拟南芥铁吸收过程中发挥着必要作用，但其作用却不是唯一的。AtBHLH29对AtFRO2和AtIRT1转录有一定的调控作用，但它可能不是唯一的调控铁吸收的转录调节因子，很可能存在着其它蛋白与其互作来共同协调铁的吸收过程。 为了更好地理解拟南芥中参与调节铁稳态(ironhomeostasis)的基因，我们对生长在含50μMFe(Ⅲ)培养基中3周的RNAi株系R119和野生型进行了Microarray分析。在这一实验分析中我们发现了另一bHLH类基因，AtBHLH101，在RNAi株系中的表达量明显高于野生型植株。在对一系列AtBHLH29RNAi株系进行半定量RT-PCR中发现，AtBHLH101的表达量随着AtBHLH29表达量的降低而逐渐升高。在野生型植株中，铁充足条件下几乎检测不到AtBHLH101的转录，缺铁可以显著诱导AtBHLH101的转录。在缺铁条件下，野生型拟南芥中的Fe、Zn、Mn的含量均高于AtBHLH101的T-DNA突变体。这表明在铁缺乏情况下AtBHLH101可能与AtBHLH29互作来调控拟南芥的铁吸收或转运过程。但是，由于AtBHLH101的缺乏并不能完全打消AtFRO2和AtIRT1的转录，因此我们认为还应该有第三者或更多的转录因子参与缺铁条件下拟南芥对铁的吸收和转运过程。 在基因枪介导的瞬时表达试验中，AtBHLH29∷GUS以及AtBHLH101∷GUS的融合蛋白均被定位在核内。在凝胶阻滞实验中发现AtBHLH29或AtBHLH101的融合蛋白均可与AtFRO2启动子区域中含有的E-box和G-box结合。在酵母双杂交实验中我们发现，AtBHLH29和AtBHLH101可以形成很强的异源二聚体，AtBHLH29可与自身形成较弱的同源二聚体，而AtBHLH101不能形成同源二聚体。为了进一步探讨二者在功能上存在的相互作用，我们研究了两个基因在洋葱表皮细胞中的共表达对AtFRO2启动子转录活性的影响。基因枪轰击后进行GUS活性染色，发现单独AtFRO2promoter-GUS质粒表达，35S-AtBHLH29或35S-AtBHLH101与AtFRO2promoter-GUS两种质粒双表达，或35S-AtBHLH29和35S-AtBHLH101与AtFRO2promoter-GUS三种质粒三重表达都可产生GUS信号，但是只有在三重表达试验中GUS的信号最强。定量分析表明单独AtFRO2promoter-GUS质粒表达，35S-AtBHLH29或35S-AtBHLH101与AtFRO2promoter-GUS两种双表达之间GUS活性没有明显差异，然而三种质粒共表达所导致的GUS活性显著高于对照或双表达。利用同样的方法我们发现，35S-AtBHLH29和35S-AtBHLH101共同表达刺激AtIRT1启动子下游的GUS基因表达，其促进强度远高于35S-AtBHLH29或35S-AtBHLH101单独表达的作用。这些结果暗示在缺铁环境中AtBHLH29和AtBHLH101可能通过形成异源二聚体共同调控AtFRO2和AtIRT1基因启动子的转录活性。