目的:本论文的主要研究目的是基于药物代谢途径,通过研究复方黄黛片中君药雄黄在体内的代谢命运,来揭示含砷制剂中有毒成分三氧化二砷的代谢行为。根据三氧化二砷在体内的代谢行为,找到含砷制剂毒性作用的新机制,为下一步探索解毒机制提供线索。同时,通过对复方黄黛片中单药与雄黄的配伍研究,初步阐释配伍减毒的可能线索,希望为其他含砷复方制剂的研发以及临床安全使用提供有用的实验依据。方法:本论文的研究分三个部分展开。第一部分,为研究无机砷毒性,本实验采用CCK8法检测三氧化二砷对不同细胞系细胞的生长抑制作用。在确证三氧化二砷对白血病细胞的膜毒性以及诱导凋亡作用时,引用流式细胞术检测了白血病细胞的凋亡和活性氧的含量;凋亡相关指标的检测则采用了实时荧光定量PCR、免疫印迹试验(Western blot)技术;同时利用ELISA法检测脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽(GSH)等膜损伤相关指标。第二部分,为进一步了解无机砷的代谢途径,本实验确定了合适的细胞对象以及给药浓度后,采用实时荧光定量PCR、Western blot以及相关技术检测三氧化二砷、丹参酮ⅡA和靛玉红对CYP450酶系统和As3MT的表达影响;并采用小分子RNA转染细胞的方法进一步解释了三氧化二砷、丹参酮ⅡA和靛玉红对As3MT的表达的影响;同时利用ELISA法检测了As3MT的酶活性。第三部分,为了掌握砷在体内代谢途径的更多证据,在动物体内实验中,采用高效液相联用电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP/MS)技术,通过检测雄黄中可溶性砷的含量以及不同价态来研究砷代谢行为。结果:结果表明,首先三氧化二砷对不同细胞系具有普遍的毒性,虽然其细胞毒性的具体机制还尚不明确,但在其使用的过程中膜毒性以及凋亡诱导的隐患会一直存在。接着在对三氧化二砷代谢研究中发现,I相代谢酶不是影响砷代谢的关键酶,而Ⅱ相代谢酶(As3MT)才是砷代谢的重要和关键酶。最后在动物水平的实验也进一步证实了雄黄能显著诱导As3MT酶活性,雄黄与丹参和青黛的配伍更加强了这一诱导作用,高活性的As3MT能使有毒的三价砷代谢清除加快。总结:纵观全文,本实验研究首次以八种细胞为研究对象,从细胞活力检测着手,确定了合适的细胞对象和给药浓度,并以Ⅱ相代谢酶(As3MT)为关键点,基于代谢的角度去探讨砷在体内的代谢行为。研究发现,一是发现Ⅱ相代谢酶(As3MT)是砷代谢的重要和关键酶,而As3MT可能是砷剂解毒的一个线索。二是配伍的实验结果提示,含砷的复方制剂在配伍使用时,如何达到增效减毒不仅仅只有剂量的考量,体内代谢调控也应时刻关注。基于以上,本实验研究期望含砷制剂在临床安全使用中可以有效规避或减少毒性风险,以及在其他含砷中药的研发中,可以基于代谢的角度,合理配伍以达到增效减毒的目的。