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在泛素介导的受体内吞作用中,胞内体蛋白分选机制决定了泛素化蛋白的去向,这一机制参与营养与代谢物摄取,生长因子与激素等的分选和处理;保持极性上皮细胞膜功能域分布特点;受体和配体再循环等许多过程,并对支持细胞许多生理功能起到重要作用,比如生物信号传导,抗原抗体结合等。胞内体蛋白分选机制中胞内体蛋白分选转运复合物(endosomal soreing complex required for transport,ESCRT)起至关重要的作用,它是与将泛素化的蛋白分选入多泡体路径(multivesicular body,MVB)有关的复合物。Tom1L1参与细胞信号传导,细胞膜和胞内体蛋白运输,在Tom 1家族中是已知功能最广泛,也是研究最热门的蛋白。研究结果表明Tom 1L1是调控EGF受体内吞的重要连接蛋白,在EGF激活细胞后,被Src家族蛋白激酶磷酸化的Tom1L1通过Grb2和Shc2与激活的EGF受体结合,并被吸引到细胞质膜上,而且Tom 1L1调节EGF受体内吞过程。我们接下来将通过深入研究Tom 1L1蛋白在胞内体蛋白分选进程中的作用机制及与ESCRT复合物、Ubiquitin的相互关系,进一步了解Tom1L1蛋白的功能和胞内体蛋白分选的机制,为今后研究相关蛋白质胞内体分选降解运输路径紊乱与疾病发生的机制,以及临床治疗策略提供理论依据。方法:1.Tom1 家族蛋白、Tollip、Hrs、STAM1/2 和 TSG101 的 siRNA 干扰。分别采用 Tom1 家族蛋白、Tollip、Hrs、STAM1/2 和 TSG101 的 siRNA 转染A431细胞,并运用Western blot来检测siRNA效果。2.研究Tom1L1与泛素化蛋白的关系。用Myc-ubiquitin单独瞬时转染的293T细胞,或与HA-Tom1,HA-Tom1L1或HA-Tom 1L2一起转染,并运用Western blot来分析蛋白表达。3.研究Tom1L1与Hrs,STAM的关系。A431稳定过表达HA标记的TomL1的A431细胞被EGF刺激过夜,然后裂解并用抗-HA抗体进行免疫印迹(IP)。蛋白质复合物通过Western blot进行分析。分别敲除Hrs和STAM1/2,敲除细胞在指定的时间内用EGF刺激。通过间接免疫荧光显微镜分析细胞以检测Tyr-Tom1L1和EGFR。4.研究敲除Tom1L1对EGFR分选的影响。A431细胞用Tom1L1 siRNA转染,然后用EGF处理30分钟。通过间接免疫荧光显微镜分析细胞以检测Tom1L1和EGFR。5.研究敲除Hrs对EGFR分选的影响。A431细胞用Hrs siRNA转染,然后用EGF处理30分钟。通过间接免疫荧光显微镜分析细胞以检测Hrs和EGFR。结果:1.结果表明Tom1家族蛋白都可以识别泛素化的蛋白质。在没有EGF刺激下,Tom1L1也可以与hrs.STAM结合,因此这种作用关系是不依赖于 Tom1L1 的磷酸化。Tom1L1 在 Hrs KO(Hrs knock out)和 STAM KO(STAM 1/2 knock out)细胞中分别可以免疫共沉淀出STAM,Hrs蛋白,表明Tom1L1不依赖于Hrs和STAM的相互作用来识别它们。2.过度表达Hrs可以吸引Tom1L1到胞内体。过度表达Hrs可以吸引Tom1L1到胞内体,这个作用不需要Tom1L1被磷酸化。在Hrs或STAM1/2敲除的小鼠MEF细胞系统中,EGF的刺激不再诱导Tom1L1从cytosal中定位到胞内体;而在Hrs-Resuce小鼠MEF细胞系统中,EGF的刺激又可以诱导Tom1L1从cytosal中定位到胞内体。3.在A431细胞中敲除Tom1L1,EGF刺激30分钟后,EGFR所在的胞内体明显变大,数量变少,表达m-Tom1L1后,胞内体体积恢复正常。在A431细胞中分别敲除Hrs,Tom1L1,可以延缓EGFR的降解,而且同时敲除Hrs和Tom1L1时,效果则更加明显。结论:1.Tom1家族蛋白可以被泛素化并识别泛素化的蛋白质。2.过度表达Hrs可以吸引Tom1L1到胞内体,过度表达STAM则没有这种效果。Hrs或者STAM敲除的细胞中,Tom1L1不再被吸引到胞内体中。这表明Hrs或者STAM在Tom1-L1从细胞质中定位到胞内体过程中起到了决定作用。3.A431细胞中分别敲除Hrs,Tom1L1,可以延缓EGFR的降解,而且同时敲除Hrs和Tom1L1时,效果更加明显,说明Tom1L1和Hrs在EGFR的胞内体分选过程中起重要作用。