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目的:胶质瘤是最常见的成人中枢神经系统原发性恶性肿瘤,这类患者病残率和病死率均非常高,中位总生存期仅10-14个月。脑胶质瘤病人在手术切除后以及放疗后往往需化疗,因此化疗成为根除脑胶质瘤细胞的可靠方法。既往有研究表明低强度超声（LIUS）能够促进胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究的目的在于探讨LIUS联合姜黄素治疗在人脑胶质瘤细胞中的抗肿瘤活动及其机制。研究方法:本研究以人脑胶质瘤细胞U87和U251为研究对象。超声强度分组:Control、50.4（U50.4）、83.4（U83.4）、142（U142）、290（U290）和474（U474）m W/cm2,辐照时间为60 s;姜黄素浓度分组如下:0（Control,DMSO）、10（C10）、20（C20）、40（C40）和60（C60）μmol/l,姜黄素的孵育时间分别为24 h,48 h和72 h;CCK-8实验结果显示超声强度142 m W/cm2在两个胶质瘤细胞中都是有效的并且对细胞的损伤最小,然后将超声强度142 m W/cm2与姜黄素不同浓度联合,分组如下:Control、U142+C10、U142+C20、U142+C40、U142+C60;基于统计分析结果以及IC50值,选取最佳的参数组合,即超声强度142 m W/cm2和姜黄素浓度20μmol/l,然后将分组设置为对照组（control）、低强度超声组（LIUS）、姜黄素组（curcumin）、低强度超声联合姜黄素组（curcumin+LIUS）。通过CCK-8和Ed U实验检测LIUS和/或姜黄素处理后对胶质瘤细胞增殖能力的影响;应用流式细胞学实验和western blot检测细胞的凋亡能力;通过吖啶橙（AO）染色、丹酰尸胺（MDC）染色以及western blot检测LIUS和/或姜黄素处理后胶质瘤细胞的自噬水平。加入自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK后通过CCK-8实验和western blot实验检测细胞增殖能力、自噬及凋亡相关蛋白表达变化。此外,使用荧光显微镜和荧光酶标仪通过探针DCFH-DA检测LIUS和/或姜黄素处理后细胞内活性氧（ROS）的水平。最后,采用western blot实验检测LIUS和/或姜黄素处理对ROS/MAPK及AKT/m TOR通路蛋白表达的变化,然后加入活性氧清除剂NAC和AKT激活剂IGF-1预处理,观察其是否能够引起LIUS联合姜黄素介导的各通路相关蛋白表达水平变化以及胶质瘤细胞增殖能力的改变。结果:1、采用CCK-8实验检测不同超声强度和姜黄素不同浓度处理后胶质瘤U87和U251细胞增殖能力的变化。结果表明,当超声强度>83.4 m W/cm2时和对照组相比细胞活力存在显著性差异,并且随着超声强度的增加胶质瘤细胞活力下降,因此,超声强度142 m W/cm2被用于如下实验中;CCK-8实验结果显示姜黄素抑制胶质瘤细胞活力以一种剂量和时间依赖方式,并且在相同孵育时间下,当姜黄素浓度>10μmol/l和对照组之间胶质瘤细胞活力存在显著性差异。在相同的姜黄素浓度下（>10μmol/l）,U87和U251细胞中姜黄素孵育时间24 h和48 h之间细胞活力存在显著性差异,而孵育时间为48 h和72 h在姜黄素浓度为60μmol/l时存在显著性差异。因此,姜黄素孵育时间为48 h时对胶质瘤细胞增殖能力的影响最为理想;通过CCK-8和Ed U实验检测LIUS联合姜黄素对U87和U251细胞增殖能力的影响,其结果显示,胶质瘤细胞在使用LIUS和不用LIUS治疗IC50值存在显著性差异。并且超声强度142 m W/cm2和姜黄素浓度20μmol/l为最优参数组合。与单独姜黄素组相比,在U87和U251细胞中LIUS联合姜黄素治疗组受抑制的细胞活力分别是姜黄素组的2.26倍和2.53倍,即联合LIUS和姜黄素以一种协同方式抑制胶质瘤细胞的增殖能力。2、流式细胞学实验结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素治疗显著增加了凋亡的胶质瘤细胞数目;western blot结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素治疗能够显著增加促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3表达水平,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。3、LIUS和/或姜黄素处理后对胶质瘤细胞自噬水平的检测,吖啶橙（AO）染色结果显示LIUS联合姜黄素显著增加了U87和U251细胞中橙红色酸性囊泡的数量,并且使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）部分阻断了LIUS联合姜黄素所诱导的酸性囊泡细胞器数量的增加;使用丹酰尸胺（MDC）染色结果表明LIUS联合姜黄素处理后MDC染色自噬空泡（AVs）相对荧光强度增加和数量增加,使用3-MA削弱了LIUS联合姜黄素所诱导的AVs荧光强度和数量的增加;western blot结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素增加了U87和U251细胞中LC3B-II和Beclin-1的表达,而P62的表达水平是下调的。4、采用CCK-8实验和western blot实验检测自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK对LIUS联合姜黄素介导的细胞抑制作用的影响。结果表明,双重使用3-MA和Z-VAD-FMK显著恢复了LIUS联合姜黄素引起的胶质瘤细胞活力的抑制（P<0.05）。Z-VAD-FMK预处理显著减少了LIUS联合姜黄素引起的Cleaved caspase-3表达增加,对比LIUS联合姜黄素处理,使用LIUS、姜黄素以及3-MA共培养处理后自噬相关蛋白LC3B-II表达减少（P<0.05）。5、DCFH-DA探针检测结果显示,和对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素能够显著促进细胞内ROS的累积。相反,使用ROS清除剂NAC显著削弱了这两个细胞系curcumin+LIUS所诱导的ROS产生;CCK-8实验结果显示,使用活性氧清除剂NAC预处理能够恢复LIUS联合姜黄素所诱导的细胞活力的抑制。6、对胶质瘤细胞进行ROS/MAPK以及AKT/m TOR通路的检测,western blot实验结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素显著性地提高了p-JNK、p-ERK以及p-p38的表达,总JNK、总ERK和总p38表达不变。然而使用NAC处理限制了LIUS-姜黄素所诱导的p-JNK、p-ERK、p-p38以及LC3B-II的表达增加;还有在U87和U251细胞中,对比对照组、LIUS组以及姜黄素组,LIUS联合姜黄素显著抑制了p-AKT和p-m TOR的表达,总AKT和总m TOR表达不变。相反,使用AKT的激活剂IGF-1预处理后逆转了LIUS-姜黄素所介导的p-AKT、p-m TOR的抑制,以及限制了LIUS-姜黄素所引起的LC3B-II表达增加;CCK-8实验结果显示,用NAC预处理以及用IGF-1预处理后,胶质瘤细胞活力均得到显著提高。结论:综上所述,LIUS联合姜黄素通过激活ROS/MAPK以及抑制AKT/m TOR通路来促进胶质瘤细胞自噬性细胞死亡。由于姜黄素很容易从姜科植物姜黄的根茎中获得,长期治疗效果温和,并且无创性的低强度超声可以局部定位到特定的部位,这种联和疗法可能成为一种很有前途的抗癌治疗策略。