论文部分内容阅读
核转录因子进入细胞核是其发挥转录活性的前提。研究发现信号转导和转录活性因子(Signal transducers and activators of transcription, STATs)家族成员不具有引导蛋白入核的核定位序列(nuclear location signal, NLS),但是细胞因子的刺激可以导致STAT短暂胞核聚集现象,因此研究STAT入核机制是一个值得探讨的课题。研究发现,STAT1和STAT3的DNA结合域中一段序列具有促进其进入细胞核的功能。那么STAT4的DNA结合域中是否也存在类似的序列,能否引导STAT4入核,目前尚无报道。目的：探讨STAT4受IL-12刺激后移位入细胞核的机制。方法：1.采用生物信息学方法将STAT1和STAT3的DNA结合域与STAT4的DNA结合域进行比对,以期找到STAT4DNA结合域上的同源序列。2.以pEGFP-C1为表达载体、采用基因亚克隆的方法构建质粒,包括：缺失395-416位氨基酸残基序列的缺失型STAT4质粒即pEGFP-STAT4-Del、将SV40大T抗原上经典的NLS核酸序列插入表达载体的阳性对照质粒pEGFP-NLS、将NLS插入缺失型STAT4的pEGFP-NLS-STAT4-Del质粒,这些质粒经过酶切消化鉴定和DNA测序鉴定,并采用免疫印迹方法确定这些质粒在真核细胞中表达3.将上述质粒转染Caski细胞,通过IL-12刺激,荧光显微镜观察荧光信号的亚细胞定位。结果：1.经过生物信息学分析发现STAT4DNA结合域上395-416位氨基酸残基序列可能是STAT4潜在的二聚体特异性NLS (dimer-specific NLS, dsNLS)。2.经过酶切鉴定和DNA序列测定证明构建了正确的质粒,包括：pEGFP-STAT4、pEGFP-STAT4-Del、pEGFP-NLS和pEGFP-NLS-STAT4-Del,将这些质粒转染真核细胞都能正确表达。3.将pEGFP-STAT4、pEGFP-STAT4-Del分别转染Caski细胞,IL-12刺激后发现野生型STAT4进入细胞核,而缺失型STAT4在IL-12刺激前后,都主要分布在细胞浆。进一步用leptomycin B (LMB)处理转染细胞,再用IL-12刺激,发现刺激Omin时野生型STAT4分布在胞浆,45min后进入细胞核,60min后阳性信号仍然在细胞核里,表明野生型STAT4受工L-12刺激被活化,形成同源二聚体,以这种形式移入细胞核；但缺失型STAT4转染细胞用LMB处理后,再用工L-12刺激,大部分阳性信号始终分布在细胞浆,表明缺失型STAT4确实不能进入细胞核；将经典的NLS序列插入缺失型STAT4中,转染该质粒,发现含有NLS的缺失型STAT4也能进入细胞核。表明STAT4的395-416位氨基酸残基序列在引导STAT4入核中起重要作用。结论：STAT4的395-416位氨基酸序列具有dsNLS功能,在IL-12刺激下,能够引导STAT4入核。