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背景与目的肝癌是我国危害最大的恶性肿瘤之一,我国肝癌发病人数约占全球的55%,死亡率约占全球的50%[1]。手术切除是肝癌患者的首选治疗方案,然而原发性肝癌的手术复发率高,进展快,患者后期往往伴随慢性肝硬化、腹水和黄疸等并发症。传统的化疗药物副作用大,因此开发副作用小的天然化合物作为治疗和减轻后期肝癌患者痛苦的辅助治疗手段是很有必要的。黄酮类化合物是广泛存在于植物界的酚类天然化合物,包括黄酮、黄烷醇、异黄酮、黄酮醇等。黄酮类化合物具有治疗心血管疾病、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抑制微生物、提高免疫力、调节内分泌等功能,并且易获取、副作用小,因此一直备受关注。清除自由基、抗氧化、改变酶的活性等是黄酮类化合物主要的药理作用机制。茶多酚是上述黄酮类化合物中常用的抗氧化植物化学物。大量的流行病学调查证实长期饮茶可以降低患癌症的风险,许多体外和体内实验也证明茶多酚及其主要有效成分EGCG具有抑制肿瘤细胞生长的作用[2,3]。然而普通茶多酚,即水溶性茶多酚的稳定性差、吸收率较低,即使体外实验证实可以抑制多种肿瘤细胞的生长,却因为在体内达不到有效浓度而在临床应用时受到限制[4,5]。EGCG是茶多酚的主要有效成分,脂溶性EGCG是将EGCG进行酯化修饰后得到的带不同酯基的混合物。酯化后的EGCG吸收率和稳定性都更好。本实验旨在用体外和体内实验探索脂溶性EGCG (L-EGCG)对肝癌细胞的抑制作用。方法体外培养的小鼠肝癌H22细胞和人肝癌HepG2细胞,分别给予0、10、20、40、80μg/ml L-EGCG作用24h,光镜下观察细胞生长情况；分别用CCK8和MTT法检测不同浓度L-EGCG作用于两种细胞12、24、48h时的细胞毒性；Hoechst/PI双染色观察细胞凋亡率；提取蛋白,Western Blot检测L-EGCG对肝癌细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响。探索用H22细胞制作ICR小鼠腋下荷瘤模型的最佳成瘤细胞数,采用该细胞数制作稳定的ICR小鼠腋下荷瘤模型,第二天分别以腹腔注射途径给予25 mg/kg环磷酰胺,灌胃给予40 mg/kg水溶性茶多酚(H-EGCG)、玉米油、25 mg/kg L-EGCG、50 mg/kg L-EGCG和100 mg/kg L-EGCG,每天一次、连续十天,处死、解剖观察L-EGCG对腋下移植瘤的抑制作用,计算抑瘤率,并与环磷酰胺和H-EGCG组进行对比。探索将HepG2细胞注射到裸鼠肝脏制作裸鼠原位移植瘤模型的手术切口位置、最佳细胞数、注射方法和位置,制作稳定的HepG2裸鼠原位移植瘤模型。术后第二天分别以腹腔注射途径给予25 mg/kg环磷酰胺,灌胃给予40 mg/kg水溶性茶多酚(H-EGCG)、玉米油、25 mg/kg L-EGCG、50 mg/kg L-EGCG和100 mg/kg L-EGCG,每天1次、每周5天,分别于1个月和3个月两个时间点,处死小鼠,解剖观察L-EGCG对肝脏原位移植瘤的抑制作用,计算抑瘤率。对3个月时间点的小鼠,观察生存时间,并取肝标本做HE染色和Masson染色,观察组织学变化。结果L-EGCG作用于肝癌细胞24h后,与对照组(DMSO)相比,光镜下形态学有明显的改变,随着L-EGCG浓度增加,越来越多的细胞出现皱缩、折光率变差、出现细胞碎片。CCK8和MTT检测结果显示,L-EGCG在12h、24h、48h对H22细胞和HepG2细胞均有抑制作用,且存在剂量效应关系和时间效应关系。Hoechst/PI荧光染色显示,L-EGCG使两种肝癌细胞凋亡率增加。Western Blot结果显示,L-EGCG增加了PARP剪切,使自噬相关蛋白p62表达增多,LC3 Ⅱ出现积累,说明诱导了细胞凋亡,同时抑制了自噬。ICR小鼠腋下注射100μ.1含10‘个H22细胞的细胞悬液,可以获得较稳定的ICR小鼠荷瘤模型。给药10天后,与玉米油对照组相比,25、50 mg/kg L-EGCG可以明显减小ICR小鼠H22细胞移植瘤的瘤重(p < 0.05)经反复探索,成功建立了HepG2细胞裸鼠原位移植瘤模型,该模型成功的关键因素包括合适的细胞浓度和注射体积(5μl,含2.5×105个细胞)、肝脏左外叶合适的注射角度和位置、注射后止血、防止细胞漏出等。建立稳定的模型,给药1个月后,与玉米油组相比,L-EGCG特别是50 mg/kg组可以显著降低肝脏原位移植瘤的瘤重(p < 0.05)。给药3个月后,玉米油组小鼠死亡一半(3/6),环磷酰胺组小鼠的移植瘤虽然瘤重减轻,但小鼠死亡并没有减少(3/6),给予 25mg/kg、 50mg/kg、100mg/kg L-EGCG的小鼠,生存数量增多,分别为5/6、6/6、4/6。虽然进行生存分析,没有统计学差异(p,0.05),但这可能是由于样本量较小的原因。HE染色和Masson染色发现L-EGCG可以促进移植瘤组织坏死,减轻肝纤维化。结论1. L-EGCG对H22细胞和HepG2细胞均有抑制作用,可能与诱导凋亡、阻断自噬后期有关；2. L-EGCG抑制ICR小鼠腋下移植瘤移植瘤和裸鼠原位移植瘤的生长；荷瘤裸鼠生存率有延长趋势。3.L-EGCG可以促进移植瘤组织坏死,减轻肝纤维化。