目的:自然杀伤(natural killer,NK)细胞是一种同时具有固有免疫和适应性免疫的免疫细胞。NK细胞是脑缺血后最早浸润入脑组织的免疫细胞之一。研究发现在急性脑缺血病人脑组织内可检测到NK细胞的浸润,并在发病24小时内达到峰值。我们实验室前期研究发现益气活血名方补阳还五汤能抑制脑缺血后NK细胞向缺血脑区的迁移,降低IFN-γ的表达水平,保护血脑屏障的结构,改善脑缺血损伤。补阳还五汤的君药是黄芪,其中黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,ASIV)是黄芪的代表活性单体成分。ASIV有保护血脑屏障、保护神经元细胞,从而对缺血性脑卒中有保护作用。本研究旨在研究黄芪甲苷抑制脑缺血后NK细胞浸润和活化从而保护神经细胞、改善脑缺血损伤的分子机制,为黄芪甲苷在缺血性脑卒中治疗中的临床使用提供药理学研究依据。方法:对体重22-26g的雄性C57BL/6小鼠,进行45分钟大脑中动脉结扎术(middle cerebral artery occlusion,MCAO)后再灌注 24 小时。ASIV 给药组在 MCAO 45分钟后再灌注时给药,12小时后再给药一次,MCAO组和假手术组给溶剂对照。通过Rotarod test和神经功能缺失评分检测ASIV对MCAO小鼠神经行为功能的影响;通过TTC染色检测MCAO组和ASIV给药组小鼠脑组织梗塞情况;通过流式细胞术和免疫组化的实验方法研究ASIV对缺血脑区、外周血和脾脏内NK细胞水平的影响;通过Real-time PCR检测脑缺血损伤后趋化因子mRNA的表达水平以及ASIV给药的影响;通过流式细胞术的实验方法研究ASIV对浸润入脑的NK细胞上激活性受体NKG2D表达水平的影响以及NK细胞分泌IFN-γ的影响。来源于小鼠大脑皮层的原代神经元在氧糖剥夺实验(oxygen and glucose deprivation,OGD)之后,通过MTT 比色法检测ASIV对原代神经元存活率的作用;通过钙黄绿素释放实验检测ASIV对NK细胞杀伤OGD神经元作用的影响;将分离纯化的NK细胞与OGD处理后的原代胶质细胞共培养,检测ASIV对NK细胞NKG2D表达水平的影响。结果:脑缺血再灌注24小时后,ASIV能显著提高MCAO后小鼠在Rotarod的停留时间,减小脑组织的梗塞体积。ASIV能抑制NK细胞向缺血脑区的浸润。脑缺血后脾脏和外周血内的NK细胞的百分比均明显下降,ASIV显著抑制了这一现象。缺血脑内趋化因子CCL2、CCL7和CXCL10的mRNA水平明显上升,ASIV能抑制这三个趋化因子mRNA水平的上调。MCAO后浸润入脑的NK细胞NKG2D的表达增加,ASIV使NKG2D的表达减少;而MCAO后脾脏和外周血中NK细胞NKG2D的表达减少,这一现象也被ASIV逆转。ASIV能抑制浸润入脑的NK细胞分泌IFN-γ。细胞OGD实验发现,小鼠皮层原代神经元在OGD之后存活率降低,而ASIV使原代神经元存活率增加。小鼠皮层原代神经元OGD之后与NK细胞共培养,ASIV能显著减弱NK细胞对神经元的杀伤作用。通过对小鼠皮层原代胶质细胞的研究发现,ASIV能有效抑制共培养的NK细胞NKG2D的表达。结论:我们的研究结果说明,ASIV具有神经保护作用;脑缺血后趋化因子CXCL10、CCL2、CCL7mRNA的表达上升,而ASIV能有效抑制这一现象,这可能是ASIV能抑制NK细胞向缺血脑区浸润的主要机制之一;ASIV能抑制浸润入脑的NK细胞上激活性受体NKG2D的表达和IFN-γ的分泌,提示ASIV可能抑制脑缺血诱导的NK细胞的活化;ASIV能提高OGD处理的小鼠皮层原代神经元的存活率,表明ASIV对脑缺血后的神经元有保护作用;ASIV抑制了 NK细胞对OGD神经元的杀伤。MCAO后脾脏和外周血内NK细胞的百分比及NK细胞表达的NKG2D减少,ASIV能逆转该现象。这些发现与我们课题组前期关于补阳还五汤的研究结果相一致,提示黄芪甲苷可能是补阳还五汤抑制脑缺血后NK细胞浸润和活化的物质基础。我们的研究为黄芪甲苷在缺血性脑卒中治疗中的应用提供了药理学研究基础。