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研究目的原发性肝癌是肝脏最常见的恶性肿瘤,同时也是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。原发性肝癌严重威胁着人类的健康,其病因和发病机制尚不完全明确,目前已知的主要致病因素有乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素B1的食入、酗酒、非酒精性肝脏疾病以及遗传性疾病等。在诸多致病因素中最重要为乙型肝炎病毒感染。目前我国大约有9300万乙型肝炎病毒携带者,其中约2千万为慢性肝炎患者。近年来研究人员发现肿瘤可能是一种干细胞性疾病,多种肿瘤中包含有肿瘤干细胞,其中包括肝癌。肿瘤干细胞在肿瘤起始、肿瘤细胞自我更新和转移过程中发挥着重要的作用。对于肝癌的治疗来说,复发是导致治疗结果不满意的主要原因。手术后肿瘤复发可能是由于残留的肿瘤干细胞在一定条件下重新启动肿瘤生长所致,所以针对肝癌干细胞的治疗有可能阻止肝癌的复发。随着分子生物学技术和免疫学技术等科研技术水平的不断提高,生物免疫疗法应用于恶性肿瘤越来越受到关注。树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗己是目前研究中的一个热点,并在基础研究和临床试验中都已经取得了积极的进展。CD133分子是肝癌干细胞的重要细胞分子标记物,本实验将从人肝癌细胞系Huh-7中分选出CD133+细胞,然后探讨负载CD133+肝癌细胞抗原的树突状细胞(DC)诱导的免疫治疗联合吉西他滨(GEM)在体外对肝癌干细胞的杀伤效应。研究方法选取常见的人肝癌细胞系Huh-7,将其扩增至一定数量,在培养至对数生长期时以CD133作为分子标志进行流式细胞分选,获得CD133+的肝癌细胞即肝癌干细胞。取健康成年人外周血进行血细胞分离,将获得的外周血单个核细胞(PBMC)在体外培养并诱导分化为树突状细胞(DC),随后负载Huh-7细胞和CD133+细胞抗原,负载抗原前后分别利用流式细胞术分析其表面分子CD80、CD83和CD86的表达情况。DC负载Huh-7细胞和CD133+细胞抗原后与T细胞共育得到特异性细胞毒性T细胞,将CD133+细胞作为靶细胞进行细胞毒性实验。实验组按处理因素分为：1.GEM组；2.CD133+-CTL组;3. GEM+CD133+-CTL组;4.Huh7-CTL组;5.GEM+Huh7-CTL组。CCK-8法检测杀伤率,然后比较各组间差异。结果1.Huh-7细胞呈贴壁型生长,生长状态良好,经流式细胞仪分选出CD133+细胞,此类细胞约占细胞群的(3.0+0.78)%,分选效率为分选效率在90%-99%。2.培养第1天的DCs均贴壁生长,胞体较小；第3天DCs贴壁疏松；第5天DCs呈聚集生长的趋势；第8天时细胞大部分悬浮或半悬浮生长,细胞突起增多。流式细胞分析显示DC负载抗原后表面分子标志明显升高,差异有统计学意义。3.对CD133+细胞的杀伤效应以GEM+CD133+-CTL组最强,与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。而单独就DC瘤苗杀伤率而言,CD133+-CTL组要高于Huh7-CTL组(P<0.05)。结论本实验研究证明了CD133+肝癌干细胞存在于肝癌细胞系Huh-7中,其在细胞群中只占一小部分。CD133+肝癌干细胞裂解产物致敏的DC瘤苗联合化疗药物可以有效杀伤肝癌干细胞,其杀伤效果要比单独应用DC瘤苗或化疗药物强。该治疗方法有可能会降低肝癌术后和肝癌肝移植后的转移和复发率,为临床治疗提供新的思路。