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大豆是世界上具有重要经济价值的农作物,大豆和微生物的互作诱导共生器官根瘤的产生,根瘤是固氮作用发生的组织,对大豆的生长发育提供重要的营养元素。大豆根瘤形成的研究已经进入了分子生物学领域,越来越多的miRNA在豆科植物中被发现,它们对豆类植物的生长发育均起着重要作用。在大豆中与根瘤相关的microRNA仅有极少数报道,研究新发现的miRNA在结瘤过程中的作用,明确这些miRNA的功能就显得尤为重要。本研究从本实验室前人工作中已经整合得到的35个新发现的microRNA中,分析和选择在数据库中至少有10个重复的microRNA,得到17个microRNA被随后用于本研究。本试验用根瘤菌USDA110侵染栽培品种Williams82后于不同时间点,通过Northern杂交的方法,对17个新发现的microRNA进行检测,获得6个有表型的microRNA,这6个microRNA分别是miR482、miR1507、miR1511、miR1512、miR1515和miR1521,发现它们在不同时间点表型各不相同,说明不同的新发现的miRNA在根瘤发育的不同阶段具有不同的表达量,启示这些新发现的miRNA在根瘤发育中不同时间或许起着不同的调控作用。随后用生物信息学方法在基因组数据库中对它们进行基因组定位,发现它们分布在1号、2号、10号、11号、17号和18号染色体上,表明它们在大豆不同组织中或许起着不同的调控作用。经过Northern杂交检测这6个miRNA在Williams 82的根、茎、叶、花、嫩荚、R5和R6的种子共7个组织中的表型,发现miR1512仅在根中表达,而其它5个miRNA在不同组织中均有表达,但是表达量和表达趋势各不相同。进一步用生物信息学软件筛选出这6个miRNA的10个候选miRNA前体,再用RNA mFold对这些前体的二级结构进行了预测,发现大豆中由根瘤菌诱导的miRNA前体在结构和长度上则存在多样性,它们介于95~145个碱基之间,表明这些miRNA在基因表达的调控中起到的作用也不尽相同;miRNA成熟序列在前体中位置上也具有多样性,有3个miRNA定位在它们前体的3′端,有2个miRNA定位在它们前体的5′端,10个前体的最小折叠自由能介于-36.6~ -63.8,具有较低的自由能,表明了这些前体预测的正确性。对上述6个经W82筛选出来的新发现的miRNA在品种Bragg中的不同时间点即0h,6h,12h,2d,6d进行检测,发现6个miRNA在不同时间点的表型和其在W82中相似。随后用Bragg的2个大豆突变体检测这些miRNA的表型,发现它们在不同突变体中的表型不同,根瘤菌B. japonicum诱导,miR482和miR1521或许并不受结瘤因子受体基因NFR1和大豆根瘤自动调控接受酶GmNARK1信号调控,但miR1511和miR1512受到调控;miR1515仅受GmNARK1调控,而不受NFR1调控。为了进一步研究上述6个miRNA的功能,我们对其靶基因进行了预测。通过生物信息学及在线大豆基因数据库,从1505条序列中筛选出来19条序列作为候选靶基因。通过Reverse Transcript -PCR的方法,对预测到的靶基因在W82不同组织、不同时间点进行检测,将得到的至少在根中表达的8个靶基因用根瘤菌侵染突变体后不同时间点的根进行定量分析,结果发现miR1521和其靶基因Gm0022x00379的表型十分匹配。并通过5’-RACE的方法对miR482,miR1512和miR1515在靶基因上的结合位点进行验证,最后miR482和miR1515在预测结合位点处同靶基因结合,但miR1512并未在预期的结合位点与靶基因结合,这可能是由于有其它机制的调控作用。在筛选出来的6个miRNA中,有4个miRNA的靶基因具有良好的表型,即miR482、miR1507、miR1512和miR1515,它们被用于研究在根瘤发育过程中的作用。构建了两套gateway过量表达载体,分别由组成型启动子CsVMV和对仅根瘤菌应答的大豆ENOD40启动子启动。通过毛状根系统生成的转基因根,用Northern杂交确证miRNA被过量表达。借助毛状根系统,设计三次根瘤统计重复实验,发现CsVMV载体系统中,miR482的根瘤数目显著增多,约是对照的2倍;miR1515的根瘤数目约是对照的1.5倍,差异显著(P<0.05),这些结果表明miR482和miR1515在大豆根中对根瘤形成过程起到一定调控作用。而过量表达的miR1507和miR1512并未引起根瘤数目的显著变化。ENOD40载体系统中,miR482的根瘤数目显著增多,约是对照的2倍;miR1512的根瘤数目亦显著增多。miR1515和miR1507并没有显著地引起根瘤数目的变化,结果表明miR482、miR1512,miR1515或许在大豆结瘤过程中起了重要的作用。