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目的:研究血管内皮细胞脱落的内皮微粒对体外培养的T淋巴细胞活化增殖、产生细胞因子及膜蛋白表达的影响,探讨内皮微粒对在急性排斥反应中的作用及部分机制。方法:1.内皮细胞的培养:①人内皮细胞株(Eahy926),用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5 % CO2、饱和湿度下培养,至Eahy926细胞生长成单层后备用;②大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)的培养及鉴定:取健康Sprague Dawley (SD)大鼠的外周肺组织,采用组织块贴壁法建立大鼠PMVEC的原代培养技术。采用形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色法对所培养的大鼠PMVEC进行鉴定。2.诱导内皮细胞活化产生内皮微粒:以TNF-α(100 ng/ml)刺激Eahy926细胞或第二代大鼠PMVEC,于48 h后收集培养液上清分离细胞微粒。3.内皮微粒的分离及定量测定:采用高速离心法分离所收集培养液上清中的细胞微粒。AnnexinⅤ-FITC荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察所分离微粒形态,并采用Bradford法进行定量测定。4.大鼠脾脏淋巴细胞的分离培养:分离健康成年Brown -Norway(BN)大鼠脾脏淋巴细胞并随机分为正常对照组、不同浓度(10、20、40μg/ml)Eahy926细胞来源EMP干预组、ConA刺激组及PMVEC来源EMP(40μg/ml)干预组。5.检测评价EMPs对T淋巴细胞的影响:①采用噻唑兰比色法(MTT法)检测淋巴细胞增值程度;②采用流式细胞术检测T细胞(CD3+淋巴细胞)早期活化分子CD69的表达;③采用ELISA法检测各组细胞培养液上清中相关细胞因子(IFN-γ,IL-2)水平的表达。④采用RT-PCR技术检测各组细胞FasL mRNA的表达。结果:1.成功培养出状态良好的PMVEC。细胞在倒置显微镜下呈现明显的上皮样细胞形态,细胞聚集成一片,外观呈鹅卵石样或铺路石样镶嵌状排列生长。经免疫组织化学对其内皮特异性第Ⅷ因子相关抗原呈阳性表达,证明成功培养出了高纯度的PMVEC。2.EMP的诱生及其分离鉴定结果:经TNF-α刺激,内皮细胞因活化而产生大量内皮微粒。激光共聚焦显微镜观察,微粒因与AnnexinⅤ-FITC结合而呈绿色囊泡状外观。我们采用Bradford法定量所分离EMP,以蛋白量计,EMP浓度在0.5~1μg/μl之间。3.淋巴细胞活化增殖测定:倒置显微镜直接观察,各EMP干预组及ConA组细胞都有较高程度的聚集生长,较对照组增殖旺盛;MTT结果显示:与对照组相比较,各Eahy926细胞来源EMP干预组、ConA组、PMVEC来源EMP干预组细胞代谢活力均显著提高(P<0.05);且与ConA组比较,EMP高浓度组、PMVEC来源EMP干预组细胞代谢活力的增高无显著差异(P>0.05)。4.T细胞早期活化标志分子CD69的表达:流式细胞术的检测结果显示,EMP各浓度组、ConA组、PMVEC来源EMP干预组CD3+细胞CD69分子的表达较对照组均明显增高(P<0.01);ConA组CD3+细胞CD69分子表达显著高于其他各组(P<0.01)。5. ELISA结果显示:与对照组相比较,EMP各浓度组、ConA组、PMVEC来源EMP干预组培养液上清IFN-γ水平较对照组有显著增高(P<0.05),且EMP各浓度组间具有明显的效量关系;而与对照组相比较,EMP中浓度组、EMP高浓度组、ConA组及PMVEC来源EMP干预组培养液上清IL-2水平显著增高(P<0.05),EMP低浓度组较空白对照组IL-2增高则无显著性差异(P>0.05)。6.FasL mRNA水平的表达:与对照组相比,EMP中浓度组、EMP高浓度组、ConA组及PMVEC来源EMP干预组FasL mRNA表达水平显著增高(P<0.01);ConA组FasL mRNA的表达增高较各EMP干预组具有显著差异(P<0.05);且EMP高浓度组与PMVEC来源EMP干预组细胞FasL mRNA表达无显著性差异(P>0.05)。结论:研究发现Eahy926细胞来源EMP及原代PMVEC来源EMP均可诱导体外培养的淋巴细胞活化增殖,诱导T细胞早期活化分子CD69的迅速表达,且细胞的活化程度与EMP干预浓度有关。另外,EMP诱导活化的T细胞分泌IL-2、IFN-γ等炎性细胞因子并高表达FasL。体内这些炎性因子及重要分子作用于免疫细胞及靶细胞,在机体免疫应答如排斥反应中发挥着重要作用。EMP可能是免疫调节性治疗的一个重要靶点。