【摘 要】
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MicroRNA（miRNA）是生物体内具有调控功能的一类非编码RNA,长度为18～24 nt,其异常表达与肿瘤的发生发展息息相关,因而可以作为疾病诊断和预后判断的生物标志物。然而,目前miRNA的分析方法主要依赖于逆转录实时定量聚合酶链式反应（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）,存在费时、假阳性、样本易丢失等缺点。为了克
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MicroRNA（miRNA）是生物体内具有调控功能的一类非编码RNA,长度为18～24 nt,其异常表达与肿瘤的发生发展息息相关,因而可以作为疾病诊断和预后判断的生物标志物。然而,目前miRNA的分析方法主要依赖于逆转录实时定量聚合酶链式反应（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）,存在费时、假阳性、样本易丢失等缺点。为了克服这些局限性,本课题创新性地提出了一种基于miRNA响应的CRISPR/Cas12a荧光传感器,将立足点介导的级联链置换反应（Cascade toehold mediated strand displacement reaction,CTSDR）与CRISPR/Cas12a系统结合产生荧光信号。靶标miRNA能够与底物探针的立足点结合,随后触发动态级联链置换反应并促进miRNA的循环。此过程产生的大量含有原间隔基序（Protospacer adjacent motif,PAM）位点的可编程双链DNA,能够作为激活剂触发Cas12a的反式切割活性,产生显著增高的荧光信号用于高灵敏检测miRNA。在最佳反应条件下,所构建的生物传感器能够检测到低至70.28 f M的miRNA,同时获得较宽的线性范围（100 f M至100 p M）。本课题构建的生物传感器具有高序列特异性,能够通过改变相应的底物探针和cr RNA的序列实现对miRNA的多重、通用检测。此外,该方法能够克服复杂基质的干扰,检测从细胞中提取的miRNA-21。鉴于该策略的高灵敏度、高特异性、普适性和易操作性等优势,其不仅可以为miRNA等生物标志物的检测提供新的分析手段,还可以扩展CRISPR/Cas12a在生物传感检测中的应用潜能。
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