【摘 要】
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多肽药物因具有特异性高、疗效好、毒性小等特点,近年来在医药市场备受关注,全球年销售额超过350亿美元,并保持快速增长。目前,经FDA批准上市的多肽药物有60多种,且超过500种多肽新药处于临床研发阶段,批准和研发的多肽药物正趋向于中长多肽（大于30个氨基酸）发展。化学法对于长度大于30个氨基酸的多肽,合成难度大、效率低、成本高,基因工程法在重组表达中长肽方面则具有一定优势。大肠杆菌是最重要的表达宿
【基金项目】
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广东省重点项目（2017A030311012）； 广州市重点项目（201904020016）；
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多肽药物因具有特异性高、疗效好、毒性小等特点,近年来在医药市场备受关注,全球年销售额超过350亿美元,并保持快速增长。目前,经FDA批准上市的多肽药物有60多种,且超过500种多肽新药处于临床研发阶段,批准和研发的多肽药物正趋向于中长多肽（大于30个氨基酸）发展。化学法对于长度大于30个氨基酸的多肽,合成难度大、效率低、成本高,基因工程法在重组表达中长肽方面则具有一定优势。大肠杆菌是最重要的表达宿主之一,特别是对于多肽或小蛋白的制备。然而,传统的基因工程法在多肽的制备中存在易降解、产率低、下游纯化繁琐的问题,特别是对于二硫键多肽的制备。因此,开发一种在大肠杆菌中高效制备二硫键多肽的方法具有重要的意义。本论文基于实验室团队开发的新一代蛋白表达与纯化技术,可切割自聚集标签法（cleavable self-aggregating tags,c SAT）,首先对L6KD-MtuΔI-CM wt架构的c SAT法表达和纯化二硫键多肽进行考察,包括重组人脑利钠肽rh BNP、促生长激素IGF-1、瘦素Leptin、趋化因子CCL-5和CXCL-12。通过该方法可以获得0.3～26.3 mg/L LB培养基的二硫键多肽,初步证明c SAT方法可用于大肠杆菌中二硫键多肽的制备。进一步,将cSAT法应用于二硫键多肽重组人脑利钠肽rhBNP的制备,并进行体系的优化和rh BNP的表征。通过研究不同聚集肽和不同内含肽对c SAT方法表达与纯化重组人脑利钠肽rh BNP的影响,确定最佳的组合方式即L6KD-MtuΔI-CM wt。随后使用发酵液培养基进行发酵测试,摇瓶水平rh BNP产量为42.8 mg/L发酵液,纯度为90.1%;2-L发酵罐水平rh BNP产量740.7 mg/L发酵液,纯度为83.4%。经c SAT法纯化后的rh BNP虽为中度纯度,但主要杂质为L6KD-MtuΔI-CM wt,后续仅需2步标准柱纯化操作,离子交换色谱和凝胶过滤色谱,即可达到＞99%的纯度。最后对精纯后的rh BNP进行表征,结果表明样品rh BNP的分子量、二级结构、氨基酸序列、二硫键均与商用标准品rh BNP相一致。本论文为二硫键多肽的高效生物制备提供了一种新的思路与技术,在rhBNP的制备上具有良好的商业应用前景。
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